3.1. Détermination du taux de matière sèche
Le taux de matière sèche (MS) des foies gras est déterminé par dessiccation du broyat à l’étuve à 105°C pendant 24 heures (J.O.C.E., 1971). Du sable est ajouté à la coupelle de façon à augmenter les surfaces d’échange. La coupelle est ensuite placée dans un dessiccateur à température ambiante afin de refroidir l’échantillon avant la pesée.
Le taux de matière sèche est alors déterminé selon la formule suivante :
MS = ((Poids sec – Tare de la coupelle) / Prise d’essai) *100 (exprimée en pourcentage du poids de foie).
3.2. Détermination du taux de Matières Azotées Totales (MAT)
Le taux de MAT est déterminé par la méthode de Dumas (AOAC, 1989) à l’aide d’un appareil Leco FP 428. La technique implique une combustion totale à 850°C, en présence d’oxygène, de la matrice protéique du foie gras contenu dans une feuille d’étain. Les gaz et
sous-produits de la combustion sont condensés à 6°C et homogénéisés. Une partie aliquote est prélevée et entraînée par un courant d’hélium à travers différents supports assurant une réduction du NO en N2 et la captation du CO2 et d’H2O. L’azote est alors détecté et quantifié à
l’aide d’un détecteur calorimétrique. L’EDTA (acide éthylène diamine tétracétique) est utilisé pour la calibration. La teneur en matière azotée totale est estimée par le calcul suivant : MAT = N x 6.25. Elle est exprimée en pourcentage du poids de foie.
3.3. Détermination du taux de lipides
Les lipides totaux sont extraits à froid dans un mélange chloroforme / méthanol (2/1, v/v) selon la méthode décrite par Folch et al. (1957), à raison de 1 gramme de foie gras broyé dans 50 ml de volume d’extraction.
Les échantillons broyés sont homogénéisés dans le mélange de solvant à l’aide d’un homogénéiseur de type ‘Polytron’. Pour optimiser l’extraction, le mélange obtenu est maintenu à 4°C pendant la nuit. Il est ensuite filtré sur un papier filtre de type Durieux. La séparation de phase est assurée par l’ajout d’une solution saline, du chlorure de sodium à 0.73%. La phase inférieure chloroformique contenant les lipides extraits est alors soutirée et filtrée sur papier filtre Whatman 1PS. Une faible quantité de sulfate de sodium est ajoutée afin de capter d’éventuelles molécules d’eau pouvant subsister dans cette phase. La quantification de lipides totaux est alors réalisée par gravimétrie après évaporation de la phase chloroformique d’une fraction aliquote.
Le taux est déterminé selon la formule suivante :
Lipides totaux = (((2/3 * Vcm) * P ) / (Pe * v)) *100, exprimés en pourcentage du poids de foie
Avec : Vcm = volume de chloroforme – méthanol employé pour l’extraction
P = Masse de lipides contenus dans le tube (poids du tube - tare) Pe = Prise d’essai en grammes
v = volume d’évaporation
3.4. Détermination du taux de collagène
La détermination du taux de collagène est adaptée de Woessner (1961) et Etherington et Sims (1981). La teneur en collagène est déterminée par dosage de l’hydroxyproline dans un
échantillon de foie gras broyé et lyophilisé. L’hydroxyproline est libérée des liaisons peptidiques par hydrolyse acide, en présence d’acide chlorhydrique 6 N, à 115°C pendant la nuit. Le filtrat est recueilli et neutralisé par ajout de soude à 1.2 N. Une solution de chloramine T à 0.05 M est ajoutée afin d’oxyder l’hydroxyproline en dérivés du type pyrrole. L’excédent de chloramine est détruit par ajout d’acide perchlorique 3.15 M. Le réactif d’Ehrlich est ensuite ajouté : le paradiaminoacétyl-4-benzaldéhyde qu’il contient va réagir spécifiquement avec les dérivés du type pyrrole pour former un composé rouge - brun absorbant à 557 nm. L’absorbance du mélange est mesurée à une longueur d’onde de 557 nm contre un blanc de H2O. Une gamme étalon d’hydroxyproline est effectuée et traitée de la
même façon que les échantillons.
3.5. Dosage de l’acide lactique et du glycogène
3.5.1. Extraction
Dans un premier temps, environ deux grammes de foie gras sont broyés à l’ultra Turax dans 10 ml d’acide perchlorique à 0.5 M. Deux rinçages de la tige du broyeur sont effectués avec 2.5 ml de solution. Le broyat est centrifugé pendant 20 minutes, à 600 g, à une température de 4°C. Les tubes sont placés dix minutes à -20°C de façon à faciliter l’élimination du ‘fat-cake’ formé pendant la centrifugation. L’échantillon est remis en suspension, et quatre aliquotes de 0.5 ml sont prélevées pour le dosage du glycogène (par le dosage du glucose total). Le broyat est alors une nouvelle fois centrifugé pendant 15 minutes à 2500 g, à une température de 4°C. Six aliquotes de 1 ml sont prélevées dans le surnageant pour le dosage du lactate.
Les aliquotes sont conservées à -20°C jusqu’aux analyses.
3.5.2. Hydrolyse du glycogène
L’hydrolyse est réalisée selon la méthode de Dalrymple et Hamm (1973). Un volume de 50 µl de KOH à 30% est ajouté dans chaque tube contenant l’aliquote de 1 ml pour neutraliser. Après agitation, un volume de 1 ml de solution d’amyloglucosidase à 2 mg/ml de tampon acétate 0.2 M pH 4.8 (SIGMA grade II) est ajouté. Les tubes sont placés au bain- marie pour une incubation de trois heures à 38°C, avec une agitation régulière. Ensuite, 100µl
de solution d’acide perchlorique à 3 M sont ajoutés de sorte à stopper les réactions enzymatiques et les tubes sont placés dans de la glace fondante pendant 10 minutes, puis centrifugés pendant 15 minutes à 4000 tours / minute. Le surnageant est filtré et récupéré puis stocké à -20°C jusqu’aux dosages.
3.5.3. Dosage du glucose
Pour le dosage du glucose (correspondant au glucose libre et au glucose issu de l’hydrolyse du glycogène), il faut tout d’abord ajouter 2 ml de tampon NAD à 100 µl de prise d’essai. Le tampon NAD est préparé comme suit : à partir de tampon triéthanolamine hydrochlorique 0.1 M pH 7.6, de l’EDTA (2 g / litre) et du MgCl2 (2 g / litre) sont ajoutés. Le
pH est ajusté à 7.6. Puis, du NAD (40 mg pour 100 ml de tampon) et de l’ATP (170 mg pour 100 ml de tampon) sont ajoutés. Enfin, les enzymes sont ajoutées au tampon : la glucose-6- phosphate déshydrogénase (G6PDH) (100 UI par ml) et l’hexokinase (100 UI par ml). L’absorbance est mesurée à une longueur d’onde de 340 nm, correspondant à l’absorbance du NADH,H+ formé lors de l’action de la G6PDH sur le glucose-6-phosphate.
3.5.4. Dosage du lactate
Le dosage du lactate est réalisé selon la méthode de Bergmeyer (1974). A partir d’un volume de 2 ml de tampon Tris Base 0.2 M Hydrazine 0.2 M et NAD 2mg/ml, pH 9, un volume de 0.1 ml de prise d’essai est ajouté. L’enzyme lactate déshydrogénase est ajoutée à une concentration de 10 U par essai. L’absorbance est mesurée à une longueur d’onde de 340 nm, correspondant à l’absorbance du NADH, H+ formé lors de l’action de la lactate déshydrogénase sur le L-lactate.
3.6. Mesure de l’oxydation des lipides
La mesure de l’oxydation des lipides est réalisée selon la méthode de Lynch et Frei (1993) adaptée par Mercier et al. (1998). Les aldéhydes formés par oxydation des acides gras poly-insaturés, dont le malonic dialdehyde, réagissent en milieu acide avec l’acide thiobarbiturique (TBA) pour former un complexe coloré en rose qui absorbe à une longueur d’onde de 535 nm.
Le broyat de foie gras est incubé avec une solution de TBA à 1% et une solution d’acide trichloroacétique (TCA) à 2.8% pendant 30 minutes à 80°C. Après refroidissement dans de la glace fondante pendant 15 minutes, une solution de n-butanol est ajoutée afin d’extraire les aldéhydes. Le mélange est centrifugé à 4°C pendant 10 minutes à 4000 g. Le surnageant est récupéré et son absorbance est mesurée à une longueur d’onde de 535 nm contre un blanc de butanol, avec une correction de la ligne de base à 760 nm. Une gamme étalon de tétraméthoxypropane est préparée et traitée de la même façon que les échantillons.
3.7. Mesure de l’oxydation des protéines
La mesure du taux de carbonyles est réalisée selon la méthode d’Olivier et al. (1987). Les groupements carbonyles sont des produits de l’oxydation des protéines, ils réagissent avec la 2,4-dinitrophénylhydrazine (DNPH) pour former un composé jaune - orange qui absorbe à une longueur d’onde de 370 nm.
Dans un premier temps, une solution de TCA à 50% est ajoutée aux échantillons de foie gras broyés de façon à précipiter les protéines. Ensuite, le culot est récupéré et incubé avec une solution de DNPH à température ambiante pendant 1 heure, sous agitation. Le mélange est centrifugé à 4°C pendant 15 minutes à 4000 g. Le culot est ensuite incubé avec un mélange éthanol - acétate d’éthyl (1/1, v/v). Cette opération de lavage du DNPH non fixé est répétée 3 fois. Après le dernier lavage, les tubes sont placés sous hotte aspirante de sorte à sécher le culot qui est ensuite solubilisé dans une solution de guanidine à 6 M à température ambiante pendant 30 minutes. Après centrifugation dans les mêmes conditions que précédemment, le surnageant est récupéré et son absorbance est mesurée à 370 nm contre un blanc de guanidine à 6 M. Une seconde mesure d’absorbance est réalisée à une longueur d’onde de 280 nm, dans une cuve en quartz.
Le taux de carbonyles formés est exprimé en nanomoles de DNPH fixé par mg de protéines selon la formule :
Taux de carbonyles = (DO370nm * 0.65) / (DO280nm * 21)
avec 0.65 : l’absorbance à 280nm d’une solution de BSA à 1 mg/ml dans de la guanidine 21 : coefficient d’extinction molaire du DNPH en mM-1 à une longueur d’onde de 370 nm.