Chapitre II : Vers le contrôle des propriétés d’émission
7. Mesure de section efficace d’absorption à deux photons
7.2. Mesure de section efficace d’absorption à deux photons de 2a
Nous avons employé comme source excitatrice un laser Titane-Saphir dont la gamme de longueur d’onde s’étale de façon générale entre 700 nm et 900 nm. En termes d’énergie, cela
correspond à la gamme couverte par la bande S0ÖS2 de 2a. Or, cette transition d’après les
calculs est dominée par un transfert de charge des parties styriliques vers l’unité pentafluorée en méso (Figure 105). -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 E ( e V ) HO BV BV+1 BV+2 BV+3 BV+4 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 E ( e V ) HO BV BV+1 BV+2 BV+3 BV+4 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 E ( e V ) HO BV BV+1 BV+2 BV+3 BV+4
Figure 105 Modélisation des orbitales mises en jeu lors de la transition optique S0ÖS2 du Bodipy 2a
Dans le but de démontrer l’influence de l’augmentation du système S conjugué, nous
avons procédé à la mesure des sections efficaces à deux photons du composé 1 et 2a, en
solution dans le DCM. Dans les deux cas, nous avons travaillé avec des solutions
référence employée est une solution aqueuse à pH 13 de fluorescéine, d’absorbance maximale égale à 0,8.
Tableau 13 Mesure de section efficace d'absorption à deux photons des composés 1 et 2a
molécules Gmax(GM)
1 8
2a 49
fluorescéine 38
Les deux composés présentent des sections efficaces d’absorption à deux photons non nulles.
Les Gmaxont été obtenus pour la même longueur d’onde d’excitation, à 750 nm. L’écart entre
les valeurs mesurées tend à confirmer que plus la conjugaison augmente, meilleur est la section efficace d’absorption à deux photons. En comparaison de celles mesurées par Ziessel
et coll. (70 GM) cette valeur est inférieure, du fait d’une conjugaison moins étendue.
La superposition des spectres d’absorption à un et deux photons (Figure 106) semble indiquer que la forme du spectre d’absorption ne varie pas trop lorsque le composé absorbe deux photons (décalage de 20 nm). Ceci suggère que les états excités « pompés » lors de l’absorption ne diffèrent pas vraiment de ceux atteints par excitation à un photon.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 300 350 400 450 500 550 600 650 700 Longueur d'onde (nm) A 0 10 20 30 40 50 60 Gma x ( G M )
Figure 106 Spectres d'absorption 1 photon et 2 photons du composé 2a 7.3. Conclusions.
Les résultats démontrent qu’il y a bien absorption à deux photons et que celle-ci est
amplifiée par l’extension de conjugaison combinée au caractère donneur-accepteur de 2a. Une
très faible partie du spectre a été balayée lors de cette étude. C’est pourquoi, en premier lieu, de nouveaux tracés de spectres d’excitation à deux photons doivent être réalisés, dans les zones 350 nm à 600 nm. Par ailleurs, il nous faut encore vérifier la bonne linéarité du
ce fluorescen
I en fonction de 2
0
La valeur deGmax= 49 GM est relativement satisfaisante, en comparaison de celle observée par Ziessel et coll. Ajouté au fait qu’il n’existe pas encore de modèle théorique prédisant
l’aptitude d’une molécule non centrosymétrique à absorber deux photons, 2a peut être
Partie 2 : Le contrôle des propriétés d’émission par
formation d’agrégats en solution aqueuse.
1. Enjeux et objectifs.
La fabrication d’assemblages de fluorophores et la vectorisation de ces derniers représentent l’un des sujets de recherche les plus actifs depuis ces dernières années. Parmi les groupes très impliqués en ce domaine, celui du Prof. O’Shea de l’University College of Dublin utilise les propriétés spectroscopiques avantageuses d’un analogue du Bodipy, l’AzaBodipy.
Très récemment, nos équipes ont conjointement développé un senseur du pH dans les milieux biologiques, basé sur le greffage d’AzaBodipy sur des nanoparticules commerciales
de taille définie.14 Le greffage du fluorophore avait alors lieu au moyen de fonctions alcools
primaires, par substitution d’un fluor en condition basique (Figure 107).
Figure 107 Conditions opératoires de greffage des AzaBodipy
La caractérisation de la liaison covalente nouvellement créée (B-O) étant délicate, les auteurs ont proposé de réaliser la substitution des fluors par du méthanol, dans les mêmes conditions. Nous avons tenté, selon ces mêmes protocoles, de greffer des Bodipy sur les deux types de billes. Malheureusement, les réactions de greffage et de substitution n’ont jamais abouti. Nous nous sommes donc retournés vers un autre procédé de greffage utilisant des billes de polystyrène fonctionnalisées en surface par des fonctions acide carboxylique.
L’idée vise à mimer le phénomène d’endocytose (ingestion de composés par des cellules) comme stimulus activateur de la fluorescence. La thèse du Dr. A. Palma a déjà établi que cette approche est viable. L’explication de ce processus repose sur le fait que lors de l’ingestion de la bille, la cellule crée une micelle autour de celle-ci. Dans le compartiment extracellulaire
14
(milieu aqueux), les fluorophores sont agrégés et ne fluorescent que très peu. La micelle les désagrège (milieu apolaire) et permet un retour de la fluorescence.
Nous présenterons dans ce présent manuscrit les résultats relatifs à des systèmes modèles, au sein desquels des surfactants serviront à construire les micelles (Figure 108).
Figure 108 Principe de fonctionnement de la réactivation de la fluorescence par contrôle de la désagrégation Ces études préalables sont nécessaires avant d’envisager une incorporation dans des milieux biologiques.
2. Aspects synthétiques.
Etant donné la nature des billes employées (PS-COOH) et la nature du milieu d’étude (eau), nous avons choisi d’utiliser un lien covalent et non hydrolysable, à savoir le lien peptidique, de façon à ne pas dégrader les assemblages de fluorophores.
L’analyse rétrosynthétique résume la démarche de greffage adoptée (Figure 109).
Figure 109 Analyse rétrosynthétique du greffage des Bodipy en surface des billes
La protection de la fonction amine par un groupe tert-butyloxycarbonyle est au préalable nécessaire pour pouvoir, d’une part, ne pas interférer lors de la seconde étape et, d’autre part, ne pas former de complexes borés lors de la synthèse finale du Bodipy. Cette protection est
quantitative. L’étherification (2ème étape) s’inspire de conditions de type Mitsonobu afin de
réaliser la substitution de la fonction alcool par l’aldéhyde phénolique. Cet adduit est obtenu
d’obtention des Bodipy à partir d’aldéhyde aromatique, mais avec un rendement extrêmement faible de 1 % (Figure 110).
Figure 110 Synthèse de 4
Ce résultat peut en partie s’expliquer par le fait que l’ajout de trifluorure de bore active la déprotection de l’amine (complexe bleu) qui forme par la suite un complexe aminotétrafluoroborate. Nous avons donc été forcés pour cette dernière étape, de travailler à froid (0°C).
Nous avons procédé au greffage de 4 en surface des billes pré-activées comme l’indique la
Figure 111.
Figure 111 Greffage de 4 en surface
Les billes que nous avons utilisées sont commerciales et sont annoncées avec un diamètre de 200 nm. Ces billes sont fonctionnalisées en surface par des fonctions acide carboxylique
(densité de fonction de surface de 0,188 mmol. g-1) que nous avons activées par des fonctions
esters, au moyen d’une réaction d’esterification (Figure 112).
OH O
O O
N DMAP, EDC, DMSO
O O N O O OH EDC = N C N N
La formation de la liaison peptidique est réalisée en une suite réactionnelle démarrant par la déprotection, en milieu acide TFA, de l’amine. Après lavage basique et évaporation du solvant, l’intermédiaire non-isolé est ensuite dissous dans du THF anhydre et mélangé, sous agitation, aux billes pré-activées. Nous avons également synthétisé de manière identique des billes « mixtes » Bodipy / AzaBodipy. Les proportions des fluorophores introduits dans la
solution sont 50/50 (450) et 90/10 (490) en Bodipy / AzaBodipy. De manière à éliminer les
fluorophores en excès qui n’auraient pas réagi, nous avons fait précipiter dans l’eau ces fluorophores libres, puis nous avons filtré les suspensions aqueuses de billes sur des cartouches de silice de pores suffisamment grands pour laisser passer les billes, mais pas les solides. En l’absence de moyen de caractérisation fiable, nous ferons l’hypothèse que la réactivité des deux fluorophores est identique et, donc, que leur ratio demeure inchangé dans la composition finale des billes (Figure 113).
Figure 113 Représentation des 3 systèmes de billes 4100, 450 et 490. Composés modèles utilisés (orange) Les caractéristiques des billes et les quantités de fluorophores introduites sont réunies dans le
Tableau 14.
Tableau 14 Caractéristiques des billes étudiées
nb de moles totales de fonction (mmol)
Nb d’éq. de fluorophores
Titre massique des suspensions
(mg / mL)
4100 4,0 10-3 1,1 2,0
490/10 4,7 10-3 1,0 0,1 2,3