Mesure de l’activité des différentes enzymes dans les conditions biochimiques

2.2.1. La lipase gastrique

Les sucs gastriques ont été recueillis chez des patients par tubage naso-gastrique, dans des conditions basales et après stimulation par la pentagastrine, à raison de 6 µg/kg de poids corporel (Dr J. Peyrot, Service d’Hépato-Gastroentérologie, Laboratoire d’exploration fonctionnelle, Hôpital Nord, Marseille, France). La lipase gastrique de différents sujets, pour lesquels l’exploration fonctionnelle n’a pas montré de pathologie gastro-intestinale, a été purifiée au laboratoire en suivant la procédure de Tiruppathi et Balasubramanian (1985). La mesure de l’activité lipolytique des sucs gastriques et des lipases purifiées a été réalisée par la technique du pH stationnaire à l’aide d’un pH-stat Metrohm (Roucaire), en se plaçant à 37°C, pH 5,40 (pH optimum d’action de l’enzyme), et en présence d’un excès de substrat à chaîne courte (la tributyrine). Au cours de l’hydrolyse des triglycérides, les acides gras générés s’ionisent plus ou moins en fonction de leur pKa et libèrent ainsi des protons qui acidifient le milieu réactionnel ; la diminution du pH est alors compensée par l’ajout de soude (N/50) versée automatiquement par une pompe dans le milieu réactionnel ; la mesure graphique du volume de soude versé, faite par un enregistreur, indique directement la quantité de micromoles d’acides gras libérés par minute, qui est ensuite traduite en activité lipase exprimée en unités U (1U = 1µmol d’AG libérée/min). Sachant qu’à pH 5,40 seulement 70 % des acides gras libérés sont ionisés et donc titrables, on réalise une titration en point final des

acides gras restants en ajoutant de la soude jusqu’à atteindre un pH de 9,40. Il faut donc réaliser, avant le dosage proprement dit, un contrôle pour évaluer la quantité de soude nécessaire pour augmenter le pH de 5,40 à 9,40 en dehors de toute lipolyse. Le milieu réactionnel contenait 0,5 mL de tributyrine, 333 µL de taurodésoxycholate à 90 mM (soit 2 mM final), 50 µl d’albumine sérique bovine (BSA) dépourvue d’acides gras à 3% (soit 1,5 µM final) (Gargouri et al., 1986a) et du tampon acétate de sodium 5 mM, chlorure de sodium 150 mM, chlorure de calcium 6 mM, pH 5,40 (qsp 15 mL). 

2.2.2. La lipase pancréatique

La pancréatine (poudre de pancréas de porc) a été préparée en solubilisant 1 g de poudre dans 10 mL d’eau distillée. Les débris insolubles ont été éliminés par quatre centrifugations successives 5 minutes à 2000 rpm. La lipase pancréatique de porc purifiée lyophilisée a été reprise dans de l’eau distillée, et la concentration en protéines a été déterminée avec le kit de dosage BCA Protein Assay Kit (Pierce). Une solution de lipase pancréatique purifiée par les soins de G. Pieroni (Rovery et al., 1978) a également été utilisée. La mesure de l’activité enzymatique de ces différentes sources de lipase pancréatique avec un pH-stat Metrohm (Roucaire) a été réalisée à 37°C, pH 7,00 (pH physiologique d’action de l’enzyme), et en présence d’un excès de substrat à chaîne courte (la tributyrine) selon le même principe titrimétrique que la lipase gastrique, mais sans dosage en point final, et en adaptant le milieu réactionnel: 0,5 mL de tributyrine, 1,35 mL de taurodésoxycholate à 90 mM (soit 8 mM final), et du tampon tris 2 mM, chlorure de sodium 150 mM, chlorure de calcium 10 mM, pH 7,00 (qsp 15 ml). Pour la lipase purifiée, l’activité a été mesurée en rajoutant dans le milieu réactionnel, 5 minutes avant l’enzyme, de la colipase de porc au rapport molaire lipase/colipase 1:1. La colipase lyophilisée a été reprise dans du tampon tris 2 mM, chlorure de sodium 150 mM, chlorure de calcium 10 mM, pH 8,00 et sa concentration a été déterminée avec le kit de dosage BCA Protein Assay Kit.

2.2.3. La lipase stimulée par les sels biliaires (BSSL)

Les différents échantillons de BSSL utilisés ont été généreusement fournis par le Professeur Olle Hernell dans le cadre d’une collaboration avec son équipe (Pr O. Hernell, Dr S. Lindquist et Dr L. Bläckberg, Department of Clinical Sciences, Umea University, Umea, Suède). Les lipases, purifiées à partir de lait humain selon la technique mise au point dans leur laboratoire (Bläckberg et Hernell, 1981) ou recombinantes (produites dans des cellules CHO, Chinese Hamster Ovary), ont été reprises dans du tampon phosphate à 10 mM et leur

concentration en protéines a été déterminée avec le kit de dosage BCA Protein Assay Kit, Pierce).

2.2.3.1. Mesure sur tributyrine

La mesure de l’activité enzymatique des différents échantillons de BSSL sur substrat à chaîne courte (tributyrine) a été réalisée par titrimétrie avec un pH-stat Metrohm (Roucaire), à 37°C, pH 7,00 (pH physiologique d’action de l’enzyme), et en présence d’un excès de substrat. Le milieu réactionnel contenait 0,5 mL de tributyrine, 333 µL de taurodésoxycholate à 90 mM (soit 2 mM final) et du tampon tris 2 mM, chlorure de sodium 150 mM, chlorure de calcium 10 mM, pH 7,00 (qsp 15 mL). 

2.2.3.2. Mesure sur trioléine

La mesure de l’activité enzymatique des différents échantillons de BSSL sur substrat à chaîne longue (trioléine) a été réalisée selon le protocole de Freed et al. (1986a) adapté de la technique originale décrite par Hernell et Olivecrona (1974). Ce protocole, établi pour du lait humain, a été adapté par nos soins pour de la lipase purifiée.

Préparation de l’émulsion substrat

Une solution contenant 26 µl de trioléine et 60 µl de trioléine marquée au tritium (triolein [9,10-3

H(N)], 1 mCi dans 2 mL de toluène/éthanol 1:1) a été préparée dans 500 µl de chloroforme/méthanol 2:1 (v/v). Le mélange a été vortexé soigneusement, avant évaporation complète des solvants sous flux d’azote, et ajout d’1 mL de gomme arabique à 10% et 1 mL de tris-HCl 1M pH 9,00. La mise en émulsion a été réalisée en soniquant le mélange deux fois deux minutes (position: 3 et fréquence de pulsation: 50%) avec une minute d’arrêt entre les deux (sonicateur Sonifier 250, Branson), puis l’émulsion obtenue a été caractérisée par un comptage de la radioactivité (scintillant Emulsifier Safe et Compteur Tri-Carb 1600 TR, Packard) et une mesure de la granulométrie (Mastersizer microplus, Malvern).

Composition du milieu réactionnel

Chaque milieu réactionnel contenait: - 25 µL d’émulsion substrat;

- 30 µL de chlorure de sodium 1M; - 6 µL de taurocholate à 400 mM;

- 30 µL d’albumine sérique bovine (BSA) à 18,7% pH 9,00; - 59 µL d’eau distillée (qsp 150 µL);

- et une prise d’essai de 33,25 ou 16,625 ng de BSSL solubilisés dans 50 µL volume final d’eau distillée (ce qui correspond respectivement à la quantité de BSSL présente en moyenne dans 50 et 25 µL de lait humain dilué au 1/200e _{dans du tampon véronal).}

Au final, les 200 µL de milieu réactionnel contenaient ainsi 1,6 mM de trioléine, 60 mM de tris-HCl, 150 mM de chlorure de sodium, 12 mM de taurocholate et 2,8% de BSA.

Déroulement du dosage

Les échantillons de BSSL ont été ajoutés extemporanément dans le milieu réactionnel et les dosages ont été menés pendant 15 minutes à 37°C dans un bain-marie thermostaté agitant réglé à 140 rpm/min. Pour les dosages blancs, l’échantillon a été remplacé par du tampon véronal 5 mM pH 7,40. Les réactions ont été stoppées par l’ajout de 3,25 mL d’une solution d’heptane/chloroforme/méthanol 100:125:141 (v/v/v) et 1,05 mL de tampon carbonate de potassium 50 mM, acide borique 50 mM, pH 10,50 (Belfrage et Vaughan, 1969). Après centrifugation 15 minutes à 1000 rpm et 22°C (extraction de 70 % des acides gras), 600 µL des 2,45 mL totaux de la phase surnageante contenant les acides gras ont été récupérés dans un pot de comptage, pour quantification de la radioactivité dans un compteur Tri-Carb 1600 TR (Packard), après ajout de scintillant (Emulsifier Safe) et homogénéisation. Pour déterminer la radioactivité totale de départ, 150 µl de milieu réactionnel mélangés à 600 µL de phase supérieure d’une extraction sans échantillon (c’est-à-dire seulement 3,25 mL de la solution d’heptane/chloroforme/méthanol et 1,05 mL du tampon carbonate de potassium) ont été comptés selon le même protocole.

Évaluation de l’activité de la BSSL

L’activité de la lipase, exprimée en µmol d’AG libérées par minute par mL de solution (c’est-à-dire en U/mL), a été calculée à partir des résultats de comptage de radioactivité, exprimés en désintégrations par minute (DPM), en appliquant la formule suivante:

(DPM échantillon – DPM dosage blanc) x 2,45 mL x 100 x 0,99 µmol x 1000

= µmol AG libérée/min/mL 0,600 mL x 70 x DPM totale de départ x 15 min x prise d’essai en µL

2.3. Mesure de l’activité des différentes enzymes dans les conditions