Mesure du coecient de diusion par la méthode du FRAP

Le coecient de diusion d'une molécule uorescente incorporée dans une mem- brane peut se mesurer par des expériences de recouvrement de uorescence après photo blanchiment (FRAP). Cette méthode consiste à photoblanchir le uoro- phore des molécules étudiées sur une aire donnée puis à analyser le recouvrement de uorescence sur cette même aire, dû à la diusion de l'objet dans la bicouche (annexe I). Dans le cadre de nos expériences, nous avons réalisé nos mesures de FRAP sur des GUVs micromanipulées (Fig. 5.9.A) pour les maintenir immobiles (annexe H). La mise au point était faite sur un des pôles de la GUV an de pho- toblanchir une surface (Fig. 5.9.B). Le signal uorescent de la molécule étudiée, lipide ou protéine, est photoblanchi sur un disque puis l'intensité du signal uo- rescent était enregistrée sur ce même disque au cours du temps (Fig. 5.9.C). La courbe de recouvrement permet d'établir un temps caractéristique (τ) dénit en fonction du plateau et de la pente à l'origine de la courbe de recouvrement. τ peut s'écrire en fonction du diamètre du disque de membrane photoblanchi (d) et du coecient de diusion D de la molécule photoblanchie :

D = d

2

16τ (5.1)

Les expériences de FRAP furent réalisées sur des aires de diamètre d comprise entre 7 et 15 µm an d'établir une courbe des τ en fonction de d2_{. Le coecient}

directeur nous permet de calculer une valeur du coecient de diusion avec plus de précision.

5.2.3 Résultat et analyse

Les protéines GL1g116 _{et GL1g}116c ont été communément utilisées pour étudier

l'activité de la protéine GL1. Dans le but de montrer, un comportement diu- sif commun et une association potentielle en oligomères identiques, nous avons réalisé des expériences de FRAP sur GL1g116 _{et GL1g}116c. Dans ces premières

expériences, les GUVs ont une phase liquide et les lipides sont tous insaturés. La composition des GL1g116_{PE GUVs est 30 mol% DOPE, 69 mol% DOPC et 1}

Figure 5.9: Mesure du coecient de diusion par la méthode du FRAP. (A) A gauche un schéma d'une GUV maintenue en position statique par aspiration avec une micropipette. A droite, photo d'une GUV en uorescence (ATTO647) et en transmission aspirée par une micropipette. Image confocale, bar d'échelle : 10 µm. (B) Schéma d'une GUV indiquant la zone photoblanchie au pôle. (C) Image du pôle d'une GUV photoblanchie sur un disque de 10 µm de diamètre, au cours du temps. Graphique du recouvrement de uorescence du lipide ATTO647 sur un disque de membrane de 10 µm de diamètre. Image

confocale en uorescence (ATTO647), barre d'échelle 10 µm.

DOPE-maléimide, 10 mol% POPS et 88 mol% DOPC. Les coecients de dif- fusion mesurés sont les suivants 4.4 ± 0.1 µm²/sec pour GL1g116 _{et 4.4 ± 0.2}

µm²/sec pour GL1g116c (Fig._{5.10.A). En parallèle, les coecients de diusion de}

deux lipides uorescents ont été mesurés, 7.5 ± 0.2 µm²/sec pour le DOPE-NBD incorporé dans des GUVs de composition 89 mol% DOPC, 10 mol% DOPS, 1 mol% DOPE-NBD, et 6.3 ± 0.5 µm²/sec pour le DOPE-ATTO647 incorporé dans des GUVs de composition 30 mol% DOPE, 69 mol% DOPC et 1 mol% DOPE- ATTO647 (Fig.5.10.A). Les coecients de diusion de GL1g116_{et GL1g}116c sont

similaires, elles ont donc un comportement diusif commun. Leur coecient de dif- fusion comparé à celui des lipides est légèrement plus faible ce qui suggère un état monomérique ou faiblement oligomérisé de la protéine ancrée sur la membrane. Les deux protéines ayant un comportement diusif similaire nous nous bornerons dans la suite de notre étude à l'utilisation de GL1g116_{qui se rapproche le plus du}

système in vivo.

La cinétique de diusion de GL1g116 _{a ensuite été mesurée sur des GUVs présen-}

tant deux phases liquides (30 mol% DOPE, 9 mol% DOPC, 40 mol% DPPC, 20 mol% cholestérol et 1 mol% DOPE-ATTO647). Les protéines étant ancrées sur des lipides DOPE, elles étaient donc ségrégées dans la phase liquide désordonnée. En conséquence, la zone choisie pour photoblanchire la protéine ou le lipide de- vait se situer dans cette phase, ce qui représentait une diculté car les domaines étaient mobiles. Les coecients de diusion mesurés sont 4.6 ± 0.5 µm²/sec pour GL1g116_{et 3.7 ± 0.1 µm²/sec pour le lipide uorescent (Fig.5.10.B). Le coecient}

de diusion de la protéine est quasiment identique à celui trouvé précédemment sur les membranes avec une phase liquide alors que celui du lipide à diminué. Cela peut s'expliquer par une sorte d'oligomérisation des lipides dans la phase liquide désordonnée mais nous ne pouvons pas l'armer. La diusion de la protéine et du lipide uorescent sont comparables ce qui conrme un état monomérique ou faiblement oligomérisé de la protéine.

L'analyse des coecients de diusion des protéines GL1g116 _{et GL1g}116c suggère

un comportement monomérique ou faiblement oligomérisé des protéines et cela indépendamment des deux compositions membranaires testées (Fig. 5.10.C). Ces résultats conrment des observations faites sur des GUVs Atg8-PE qui montrent un recouvrement de uorescence similaire de la protéine et des lipides à l'issue d'une expérience de FRAP [70]. An de déceler la présence ou non de petits oligomères de protéines GL1g116_{-PE, nous allons eectuer une expérience supplémentaire de}

Figure 5.10: Coecients de diusion de GL1g116 _{et GL1}g116c_{. (A)}

Graphique des coecients taux de recouvrement en fonction du diamètre au carré de l'aire de membrane photoblanchie pour la DOPE-NBD, DOPE- ATTO647, GL1g116_{et GL1}g116c_{sur des membranes sans microdomaines. Les}

coecients de diusion correspondant sont écrits à la droite du graphique. (B) Graphique des coecients taux de recouvrement en fonction du diamètre au carré de l'aire de membrane photoblanchie pour la DOPE-ATTO647 et GL1g116

sur des membranes avec des microdomaines. Les coecients de diusion corres- pondant sont écrits à la droite du graphique. (C) Récapitulatif de l'ensemble

5.3 GL1 est monomérique ou faiblement oligomé-