Fonctionnalité de GL1 ancré sur les GUVs

Lors de la formation des GL1g116_{-PE GUVs, les protéines sont sujettes à des cycles}

de déshydration et réhydratation. Ce traitement pourrait modier le repliement de la protéine et donc avoir des conséquences sur sa fonctionnalité. Nous avons donc soumis les GL1g116_{-PE GUVs à un test de clivage avec la protéase RavZ prouvant}

la conservation de la structure tridimensionnelle de la protéine.

Sur des membranes biologiques ou modèles, GL1g116_{-PE est un substrat pour la}

protéase RavZ, produite par la bactérie Legionella pneumophila [37] (voir2.1.2), la protéine est clivée entre le 115ème et le 116ème résidu (Fig.4.10). Il est important de noter que ni la protéine GL1g116 _{seule ni la protéine GL1}g116_{-PE solubilisée}

dans du détergent ne sont reconnues par RavZ et clivées, le clivage témoigne donc d'une bonne incorporation de GL1g116_{dans la membrane. De même, si la protéine}

Figure 4.9: Quantication de la protéine GL1g116 _{incorporée dans la}

membrane de GUVs avec la méthode du choc osmotique. (A) Graphique de l'intensité de uorescence des uorophores ATTO488 et Alexa488 en solution pour diérentes concentrations en mM. (B) Graphique de l'intensité de uo- rescence des GUVs pour diérents pourcentages molaires de DOPE-ATTO488 incorporés. Les GUVs ont été préparées avec la méthode du choc osmotique et sont composées de lipides DOPC et de lipides DOPE-ATTO488. (C) Graphique du pourcentage molaire d'Alexa488 sur les GUVs en fonction de l'intensité de uorescence à la membrane. Ce graphique a été construit grâce aux graphiques (A) et (B). Le point gris indique la position des GUVs GL1g116_{-PE, statistiques}

réalisées sur une vingtaine de GUVs. L'intersection de la droite avec l'axe des x pour une intensité de uorescence non nulle signie que le fond uorescent est non nul. Il est dû aux protéines GL1g116 _{non incorporées, il peut donc varier}

d'une expérience à l'autre et doit être remesuré à chaque expérience. (D) Gra- phique du pourcentage molaire de GL1g116 _{incorporés dans la membrane des}

GUVs en fonction du signal uorescent d'Alexa488 à la membrane. Le point gris indique la position des GUVs GL1g116_-PE.

De ce fait, l'activité protéolytique de RavZ sur GL1g116 _{peut être utilisée comme}

témoin de la conservation de sa structure tridimensionnelle.

Au préalable à la réaction de clivage, les petits liposomes GL1g116_{-PE ont été}

incubés 20 min à température ambiante, à 41 °C ou bien à 90 °C, an de tester l'eet de la température sur le repliement de la protéine. Puis, 10 nM de protéines RavZ ont été ajoutés et la mixture placée à 37 °C pendant 10 min. Enn, l'an- crage de GL1g116 _{dans la membrane a été contrôlé sur gel (Fig. 4.11). Ce test}

Figure 4.10: Site de clivage de la protéase RavZ. Séquence de la protéine GL1, le site de clivage de la protéine RavZ est indiqué par la ligne pointillée

située entre le 115ème et le 116ème résidu.

de clivage a été réalisé sur deux populations de petits liposomes avec des com- positions lipidiques diérentes, une première composée de 30 mol% DOPE et 70 mol% DOPC (composition 1), une seconde de 30 mol% DOPE, 10 mol% DOPC, 40 mol% DPPC et 20 mol% cholestérol (composition 2). Le clivage de la protéine restée à température ambiante est complet, celui de la protéine incubée à 90°C est inexistant puisque la protéine a perdu sa structure tridimensionnelle et enn celui de la protéine incubée à 41°C est quasi-total, signiant qu'une faible portion de la protéine s'est dépliée.

Ensuite, nous avons testé le clivage de la protéine directement sur des GUVs GL1g116_{-PE en les incubant avec 10 nM de RavZ à température ambiante pen-}

dant 40 min. Lors de leur formation les GUVs GL1g116_{-PE étaient placées à 41}

°C, donc si nous voulons comparer le clivage des protéines sur les GUVs à celui sur les petits liposomes, il faut prendre pour point de comparaison les liposomes incubés 20 min à 41 °C. Ce test de clivage a été réalisé sur deux populations de GUVs avec des compositions identiques à celles utilisées pour les petits liposomes (composition 1 et 2). Le signal uorescent de la protéine sur les GUVs s'est trouvé réduit de 51 ± 12 % dans la population de GUVs de composition 1 et de 63 ± 8 % dans la population de GUVs de composition 2. Puisque, la protéine est répartie de façon équitable sur les deux côtés de la bicouche, celle sur la paroi interne reste inaccessible et seules les protéines présentes sur la paroi externe pouvaient être clivées (Fig. 4.12). En conclusion, toutes les protéines GL1g116_{-PE accessibles ont}

été clivées ce qui signie que la protéine conserve sa structure tridimensionnelle après utilisation de la méthode du choc osmotique à 41 °C et cela pour diérentes compositions lipidiques des bicouches.

Figure 4.11: Clivage de GL1g116 _{ancré sur des petits liposomes par la}

protéase RavZ. Gel des solutions de liposomes GL1g116_{-PE pour deux com-}

positions lipidiques, composition 1 : 30 mol% DOPE et 70 mol% DOPC, com- position 2 : 30 mol% DOPE, 10 mol% DOPC, 40 mol% DPPC et 20 mol% cholestérol. Après la réaction de lipidation les solutions de GL1g116_{-PE lipo-}

somes étaient incubées pendant 20 min à 23 °C (température ambiante), à 41 °C ou à 90 °C. La protéase RavZ était ensuite ajoutée à la solution de liposomes GL1g116_{-PE à une concentration de 10 nM, la mixture était ensuite incubée 10}

min à 37 °C. La photo du gel est prise en uorescence (Alexa 488).

L'activité protéolytique de RavZ ne fonctionne pas sur les GUVs GL1g116c-PE

puisque la glycine G116 a été mutée en une cystéine, nous n'avons donc pas pu tester le repliement de la protéine GL1g116c après l'application du choc osmotique.

Néanmoins étant données les similarités structurelles de GL1g116 _{et GL1g}116c,

nous pouvons supposer que la protéine GL1g116c a conservé sa structure tridi-

mensionnelle.

4.6 Unilamellarité des vésicules formées par la mé-

thode du choc osmotique

An de démontrer l'unilamellarité des vésicules géantes formées par la méthode du choc osmotique, nous avons analysé le signal uorescent du lipide ATTO647 incorporé dans la membrane selon une méthode développée par Akashi [86]. Cette analyse a été réalisée sur des GUVs et des GUVs GL1g116_PE.

Figure 4.12: Clivage de GL1g116 _{ancré sur des GUVs par la protéase}

RavZ. Le test de clivage a été eectué sur deux populations de GUVs de compo- sitions diérentes, composition 1 : 30 mol% DOPE et 70 mol% DOPC, composi- tion 2 : 30 mol% DOPE, 10 mol% DOPC, 40 mol% DPPC et 20 mol% cholestérol. Après la formation des GUVs GL1g116_{-PE avec la méthode du choc osmotique,}

10 nM de protéase RavZ était ajouté. La mixture était ensuite incubée 40 min à température ambiante. (A) Schéma du clivage de GL1g116 _{incorporé dans}

une GUV, les protéines ancrées sur la paroi interne ne sont pas accessibles elles ne peuvent donc pas être clivées. (B) Images prises au microscope confocal en uorescence (Alexa488) de GUVs GL1g116_{-PE micromanipulées avant et après}

l'ajout de RavZ. Barre d'échelle : 10 µm. (C) graphique des intensités de uo- rescence d'Alexa488 sur la membrane des GUVs avant et après l'ajout de RavZ, pour les compositions 1 (à gauche) et 2 (à droite). Les diérences d'intensité de uorescence entre les compositions 1 et 2 proviennent d'une diérence de réglage

du microscope lors de l'observation.

Les GUVs et les GUVs GL1g116_{PE contiennent 1 % de lipide ATTO647 dans}

leur membrane. En mesurant l'intensité du signal uorescent du lipide à la mem- brane pour un grand nombre de vésicules, 2 à 4 populations peuvent se distinguer (Fig. 4.13.A), la mesure de l'intensité de uorescence à la membrane de la GUV est décrite en annexe F. La distribution de ces intensités présente des pics mul- tiples du pic le plus faible. Ce dernier étant le signal uorescent émis par une bicouche. Les vésicules formées par la méthode du choc osmotique sont à 82 % unilamellaires et les vésicules GL1g116_{PE le sont à 68 % (Fig. 4.13.B et C). La}

diminution de la proportion de vésicules unilamellaires lorsque celles-ci portent la protéine GL1g116 _{n'est pas surprenante. En eet, en solution les petits liposomes}

GL1g116_{PE s'agrègent rapidement (voir 3.4), puisque GL1}g116 _{entraîne l'adhé-}

sion des membranes [72], la présence de la protéine favorise donc les structures multilamellaires lors de la formation des GUVs GL1g116_{PE par la méthode du}

Figure 4.13: Unilaméllarité des vésicules et GL1g116_{PE vésicules for-}

mées par la méthode du choc osmotique. La composition des GUVs est 30 mol% DOPE, 69 mol% DOPC, 1 mol% DOPE-ATTO647. (A) Les pics d'in- tensité de uorescence (ATTO647) à la membrane des GUVs sont des multiples du pic le plus faible. Ce dernier étant le signal uorescent émis par une bi- couche. Les images sont prises au microscope confocal et donnent l'exemple de vésicules formées d'1, 2, 3 et 4 bicouches. Le graphique montre l'intensité de uorescence relevée au niveau de la ligne pointillée blanche. Barre d'échelle : 10 µm. (B) Distribution de uorescence de vésicules formées par la méthode du choc osmotique. Quatre populations peuvent se distinguer, 82 % des vésicules sont unilaméllaires. (C) Distribution de uorescence de GL1g116_{PE vésicules}

formées par la méthode du choc osmotique. Deux populations se distinguent, 68% des GL1g116_{PE vésicules sont unilaméllaires.}

Chapitre 5

Répartition et oligomérisation de

GL1 sur des bicouches plates de

diérentes compostions

Lors de sa croissance, l'autophagosome adopte une forme de coupe, il croît donc de façon asymétrique. L'intervention de machineries protéiques sur la membrane du PA lors de sa formation s'opère donc très probablement de façon non uni- forme à sa surface. Notre protéine d'étude GL1 qui rappelons-le est le marqueur de l'autophagosome et est responsable de l'adhésion des membranes, se répartie très certainement de façon inégale sur le PA. De plus, le fort potentiel de GL1 à l'oligomérisation (voir2.3.3), laisse supposer que des associations de la protéine en cis joueraient un rôle dans son activité. Dans le but de déterminer des conditions membranaires qui justieraient une répartition spécique ou une oligomérisation de la protéine, nous nous sommes intéressés aux rafts. Ces derniers sont présents sur les membranes cellulaires et jouent un rôle biologique notamment dans la répar- tition des protéines. Nous avons donc reconstitué la protéine GL1 dans des GUVs avec des microdomaines et nous avons étudié sa répartition et son oligomérisation. Dans ce chapitre, nous étudierons dans un premier temps la répartition de GL1 sur des GUVs avec des microdomaines en fonction de la chaîne lipidique d'ancrage de la protéine. Ensuite, nous nous intéresserons à l'oligomérisation de la protéine en analysant d'abord sa diusion puis en réalisant des expériences de photoblan- chiment par palier.

5.1 Répartition de GL1 en fonction de la chaîne