Les caractéristiques membranaires des GUVs limitent l'in-

La reconstitution de GL1g116 _{dans des petits liposomes est bien maîtrisée [68,72].}

Cependant, le passage des petits liposomes à des liposomes géants entraîne des modications profondes de la structure de la membrane qui limitent l'incorporation de GL1g116 _{et obligent à repenser le protocole traditionnel. En eet, nous n'avons}

jamais pu visualiser la protéine GL1g116 _{en uorescence sur la membrane des}

GUVs en utilisant la réaction de lipidation employée sur des petits liposomes. Les GUVs utilisées lors de ces tests étaient électroformées en utilisant la méthode développée par Angelova [82] et détaillée en annexeL. Pour la décrire simplement, cette technique consiste en l'application d'un courant alternatif sur un lm de lipide déposé sur des plaques d'ITO et réhydraté dans de l'eau. Les GUVs formées à l'issue de l'électroformation sont grandes (10 µm  100 µm) et nombreuses. L'ancrage de GL1g116 _{sur les GUVs était inexistant ou inférieur à notre limite}

de détection de uorescence. Bien que certaines équipes, aient pu obtenir des résultats positifs, des diérences signicatives dans la composition lipidique des GUVs ou dans le système d'ancrage de la protéine [76] montre que la lipidation de la protéine sur des GUVs par la réaction naturelle est peu ecace. Une équipe à pu reconstituer la protéine Atg8 dans des GUVs via la réaction enzymatique en utilisant des GUVs composées à 68 % de lipides PE [73], cette concentration étant largement supérieure à des concentrations physiologiques.

Pour nos compositions qui sont plus physiologiques avec 30  40 % de lipide PE, La faible incorporation de GL1g116 _{est certainement due au faible ancrage de la}

protéine Atg3 et Atg3k11w_{. En eet, les défauts membranaires nécessaires à la liai-}

son d'Atg3 sont certainement moindres sur la surface des GUVs, leur membrane est moins tendue et se replie ce qui pourrait limiter l'accessibilité aux parties hy- drophobes de la membrane. L'utilisation de protéines Atg3 et Atg3k11w_exprimées

avec une YFP au N-terminal atteste cette hypothèse. Nous rappelons ici que la protéine Atg3 mutante est moins sensible aux défauts présents à la surface de la bicouche. Lors du mélange de la protéine Atg3 avec des GUVs contenant 40 % de lipides PE, aucun signal uorescent de la protéine n'était observé sur la membrane

(Fig. 4.1). Dans des conditions expérimentales identiques, l'utilisation de la pro- téine Atg3k11w _{donnait des résultats irréguliers. En général, aucun signal n'était}

visible sur la membrane, mais quelquefois un faible signal était observable alors que les conditions d'expérimentation étaient identiques. Nous ne savons pas aujour- d'hui expliquer ces variabilités dans nos observations. Puisque les protéines Atg3 et Atg3k11w_{ne s'ancraient pas ou peu dans la membrane, nous étions convaincus}

que la membrane des GUVs ne permettait pas un bon recrutement de GL1g116_.

Figure 4.1: Ancrage de la protéine Atg3 ou Atg3k11w sur des GUVs.

Des GUVs préparées par électroformation (DOPE 40 mol%, POPC 49 mol%, POPS 10 mol%, DOPE-rhodamine 1 mol%) étaient mixées avec 1 µM de protéine Atg3 ou Atg3k11w. Le mélange incubait à température ambiante, la photo de la

GUV mélangée avec de la protéine Atg3 a été prise après 10 min d'incubation, celle avec la protéine Atg3k11w 180 min. Les images sont prises au microscope

confocal en uorescence celle du haut correspondent à la rhodamine (rouge) et celle de bas à la YFP (vert). Barre d'échelle : 10 µm.

Une autre stratégie consistait à utiliser la protéine mutante GL1g116c se liant di-

rectement à un lipide maléimide et ne nécessitant pas d'enzyme, ce qui permettait d'éviter l'utilisation de la protéine Atg3. Cependant, cette méthode fut tout aussi inecace. Nous supposons que la cystéine au C-terminal de la protéine n'était pas susamment accessible dû à la forme globulaire de la protéine, ce qui ne permet- tait donc pas un ancrage signicatif de GL1g116c. Des tests menés en parallèle

sur des bicouches supportées de composition identique à celles des GUVs (5 mol% de DOPE maléimide, 85 mol% POPC, 10 mol% POPS) confortent cette hypo- thèse. La protéine ne s'incorporait pas ou très faiblement de façon spécique. Les bicouches étaient préparées avec une cuve de Langmuir et la protéine GL1g116c

du protocole est donné en annexeM. En général, l'ancrage de la protéine sur la bi- couche était non spécique comme le montre les signaux uorescents relevés après injection de la protéine sur des bicouches avec et sans lipide maléimide (Fig. 4.2). Nous avons pu obtenir un faible ancrage spécique seulement une fois au cours d'une série d'expériences, pour des raisons inconnues.

Figure 4.2: Ancrage de la protéine GL1g116c _{sur des bicouches sup-}

portées. Les bicouches sont préparées avec une cuve de Langmuir, les composi- tions sont les suivantes : 5 mol% de DOPE maléimide, 85 mol% POPC, 10 mol% POPS ou 90 mol% POPC, 10 mol% POPS (contrôle négatif). La protéine GL1 est ajoutée sur la bicouche à une concentration de 1 µM. La bicouche incube en- suite 30 min à température ambiante avant l'observation au microscope confocal. Un stack en z est ensuite réalisé au niveau de la bicouche pour relever le signal uorescent de l'YFP, la bicouche se situe au niveau du pic de uorescence. Les schémas représentent la bicouche avant et après l'injection de GL1g116c_{. Les}

graphiques du haut correspondent au signal uorescent relevé avant l'injection de la protéine sur les bicouches avec 5 mol% de maléimide (gauche) et 0 mol% de maléimide. Les graphiques du bas correspondent au signal uorescent re- levé après l'injection de la protéine sur les bicouches avec 5 mol% de maléimide

(gauche) et 0 mol% de maléimide (droite).