Nous avons investigué la toxicité aiguë des extraits aqueux et des huiles essentielles des deux espèces conformément à la méthode de toxicité aigue orale décrite dans la ligne directrice OCDE 423 (OCDE, 2002).
Cette méthode est reproductible, utilise très peu d‟animaux et différente des autres méthodes de toxicité aiguë (Lignes directrices 420 et 425). Elle permet de classer des substances par ordre de toxicité de façon similaire. Une dose déterminée de la substance est administrée par voie orale à un groupe d‟animaux.
L‟absence ou la manifestation de mortalité liée à la substance dans un groupe ayant reçu une dose à une étape donnée détermine l‟étape suivante, c‟est à dire:
Arrêt de l‟essai,
Administration de la même dose à trois animaux supplémentaires,
Administration de la dose immédiatement supérieure ou inférieure à trois animaux supplémentaires.
L‟expérience est effectuée pour chaque étape sur trois souris suisses femelles non gravides, âgées de 2 à 2.5 mois, leur poids se situe entre 20 et 30 g, ces souris sont gardés sains et à jeun (on supprime la nourriture mais pas l‟eau) 4 h avant et 2 h après l‟administration orale des extraits aqueux et des huiles essentielles de Melissa officinalis et de Mentha rotundifolia, la dose initial choisi est de 300 mg/kg. Ces animaux proviennent de l‟animalerie centrale de la Faculté de Médecine et de Pharmacie de Rabat, elles sont maintenues dans des conditions de température 22°C (± 3), de taux d‟humidité 30-70 % et d‟éclairage 12 heure lumière et 12 heure obscurité.
L‟extrait aqueux est administré en solution dans l‟eau distillée et l‟huile essentielle est administrée en solution dans l‟huile d‟arachide par voie orale, sous un volume de 0.5 ml pour 20 g de poids corporel. Les souris traitées sont gardées en observation de façon continue le jour de gavage pour noter toute perturbation immédiate. L‟observation des variations de poids, de taux de mortalité, de comportement de l‟animal et des signes de toxicité est réalisée également durant les 14 jours qui suivent l‟exposition pour déceler d‟éventuels effets retardés des extraits.
Après la détermination de la toxicité aigue des extraits des deux espèces (Melissa officinalis et
Mentha rotundifolia), nous avons testé l‟huile essentielle de Melissa officinalis et l‟extrait
aqueux de Mentha rotundifolia pour une administration répétée durant 90 jours c‟est la toxicité subchronique selon la ligne directrice de l‟OCDE 408.
II. Etude de la toxicité chronique de l’huile essentielle de Melissa officinalis
et de l’extrait aqueux de Mentha rotundifolia
La toxicité chronique est l‟étude de l‟effet d‟une substance quelconque sur des animaux de laboratoire auxquels on administre une dose de façon réitérée, pendant une période de 3 mois. L‟étude de la toxicité chronique permet :
D‟évaluer la toxicité d‟une substance administrée à plusieurs reprises, cette toxicité résulte du produit lui-même et/ou de ses métabolites.
De mettre en évidence des altérations fonctionnelles et/ou anatomopathologiques provoquées par l‟administration réitérée et établir leur apparition en fonction de la posologie.
De définir les limites de l‟innocuité expérimentale.
D‟apprécier le degré de réversibilité des effets toxiques. II.1. Extraits testé
L‟huile essentielle de Melissa officinalis en solution dans l‟huile d‟arachide (100 et 200 mg/kg ; VO). Et l‟extrait aqueux de Mentha rotundifolia est dissout dans de l‟eau distillée pour obtenir les doses de 300 et 600 mg/kg qui sont administrées au volume de 1 ml / 100 g de poids corporel des rats.
Les doses utilisées sont inférieures à la DL50, et n‟ont pas causées la mort d‟animaux lors de l‟étude de la toxicité aigue sur les souris. Pour ce faire, nous avons travaillé avec des doses correspondant au un dixième de la DL50, soit 100 et 200 mg/kg pour l‟huile essentielle de
Melissa officinalis et 300 et 600 mg/kg pour l‟extrait aqueux de Mentha rotundifolia.
II.2. Animaux
Les rats de souche Wistar utilisés proviennent de l‟élevage de l‟animalerie centrale de la Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université Mohammed V de Rabat. Ils ont été répartis en 6 lots de 12 rats, chaque lot est homogène formé de 6 mâles et 6 femelles, mis séparément dans des cages (les femelles séparées des mâles). Les rats pesant entre 180 et 200 grammes et sont préalablement marqués et gardés sous conditions standards (22 ± 3° C; 12/12 h cycle lumière/obscurité). Tous les animaux avaient un accès libre à l'eau. Ils ont été acclimatés pendant 5 jours avant le début de l'étude.
II.3. Test de la toxicité chronique
La toxicité chronique par voie orale a été réalisée selon la ligne directrice de l’OCDE 408 et 452 pendant 90 jours. Deux lots servent de lot témoin ; le premier reçoit de l‟eau distillé puisqu‟elle est le véhicule pour l‟extrait aqueux et le deuxième reçoit de l‟huile d‟arachide pour l‟extrait de l‟huile essentielle. Les 4 autres lots sont les lots d‟animaux traités avec les extraits à tester. Pendant toute la période d‟exposition, nous avons suivi leur poids corporel par la pesée chaque semaine et noté leur comportement. Et afin d‟évaluer l‟impact des extraits sur certains organes et sur le métabolisme des animaux, nous avons réalisé des prélèvements sanguins en vue d‟effectuer des tests hématologiques et biochimiques en relations avec la fonction hématologique, hépatique et rénale. Les prélèvements sanguins ont été effectués, en quatre temps différents ; T0 : Prélèvement témoin, avant le traitement. T1, T2 et T3 après chaque 30 jour de traitement.
Les rats sont mis à jeun pendant une nuit et les prélèvements ont été effectué à l'aide d'une pipette pasteur héparinée à travers le sinus rétro-orbital au niveau de l'œil après une légère anesthésie à l‟éther. Le sang est prélevé sur EDTA (pour les paramètres hématologiques), et sur tube hépariné (pour le bilan biochimique) en vue de l'analyse des paramètres biochimiques et hématologiques.
A partir de ces prélèvements, les paramètres suivants ont été déterminés : 3.1. Paramètres biochimiques
Les tubes héparinés sont centrifugés à 4000 tours/min pendant 10 min. Le sérum préparé à partir de ces échantillons pour déterminer les paramètres biochimiques suivants : Glucose, Créatinine, Urée, Alanine aminotransférase (ALAT) et Aspartate aminotransférase (ASAT). 3.2. Paramètres hématologiques
Les échantillons de sang prélevés sur EDTA ont été immédiatement utilisés pour déterminer les taux de globules blancs, de globules rouges, de plaquettes, de la formule leucocytaire, de l‟hémoglobine et de l‟hématocrite.
Les dosages (hématologique et biochimique) ont été réalisés au laboratoire du Centre Hospitalier Universitaire, IBN Sina de Rabat.
A la fin de test, tous les animaux survivants ont été sacrifiés après anesthésie avec l'éther. Le cœur, les poumons, le foie, les reins, et la rate sont prélevés pour réaliser des analyses histopathologiques. Ces dernières ont consistées pour la recherche d‟éventuelles conséquences lésionnelles du traitement sur ces organes, par des analyses macroscopiques et microscopiques. Une fois l‟organe prélevé, il était pesé et conservé dans un flacon contenant le formol à 10% afin d‟éviter sa dessiccation. Chaque organe a fait l‟objet d‟une analyse microscopique.
Les analyses histopathologiques ont été réalisées au laboratoire d‟anatomopathologie du Centre Hospitalier Universitaire, Hôpital des enfants-Rabat.