I. Evaluation du pouvoir antioxydant
Beaucoup de tests sont utilisées pour évaluer l‟activité antioxydante des extraits. La plupart de ces tests sont basées sur la coloration ou la décoloration d‟un réactif dans le milieu réactionnel. Dans notre étude nous avons utilisé trois tests à savoir : Le test DPPH, FRAP et ABTS. Des modifications ont été, cependant, apportées afin de les optimiser et de les adapter à notre étude.
I.1. Test au DPPH
L‟activité antioxydante des extraits a été mesurée in vitro par le 2,2‟-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), dont le DPPH est un radical libre stable de couleur violacée qui possède une bande d‟absorbance à 517 nm.
Le test utilisé au laboratoire est basé sur celui décrit par (Huang et al, 2011) en y apportant quelques modifications. Il consiste donc à mélanger, dans un tube en verre, 0.5 ml de solution méthanolique de DPPH (0.2 mM DPPH, dissous dans le méthanol) avec 2.5 ml de la solution d‟extraits. Le mélange est vigoureusement agité, puis les tubes sont incubés à température de laboratoire et à l‟obscurité pendant 30 minutes. L‟absorbance a été lue à 517 nm en utilisant un spectrophotomètre UV/Vis (SHIMADZU-2450). La décroissance de l‟absorbance est convertie en pourcentage d‟activité antiradicalaire est estimée selon l‟équation suivante :
Activité Antiradicalaire (%) = (A témoin ŔA échant / A témoin) x 100
A témoin : Absorbance du témoin
A échant : Absorbance des échantillons testés
I.2. Test de la réduction du fer « FRAP »
Le test de la réduction du fer est considéré comme un test direct et rapide est utilisé pour mesurer le pouvoir des antioxydants non enzymatiques.
Le protocole est basé sur la méthode décrite par Oyaizu en 1986, qui a subi quelques modifications.
Différentes concentrations de chaque extrait et de l‟acide ascorbique standard ont été mélangé avec 2,5 ml d‟une solution tampon phosphaté (0,2 M, pH 6,6) et 2,5 ml d‟une solution de ferricyanure de potassium K3Fe(CN)6 à 1 %. Les solutions ont été secouées immédiatement et bien mélangées, puis ils sont maintenus dans un bain-marie à 50°C pendant 20 min. Ensuite, 2,5 ml d‟acide trichloroacétique à 10% est additionné au mélange réactionnel. Le tout est
mélangé avec 2,5 ml d‟eau désionisée et 0,5 ml d‟une solution aqueuse de chlorure ferrique FeCl3 à 0,1%. L‟absorbance est mesuré à 700 nm contre un blanc.
I.3. Test de la capacité antioxydante en équivalent Trolox ou «ABTS»
Le test ABTS a été réalisé en utilisant la méthode de Re et al., 1999. Le radical cationique ABTS+ a été obtenu par la réaction entre 10 ml d‟ABTS à 2 mM et 100 µl de persulfate de potassium à 70 mM. Le mélange est mis en incubation, à l‟obscurité, pendant 24 heures à température ambiante. La solution d‟ABTS+ est diluée avec du méthanol pour obtenir une absorbance de 0.7 à 734 nm. Tous les échantillons ont été réalisés en triplicat. En diluant 100µl d‟extrait dans 2 ml de la solution d‟ABTS+, une minute après, l‟absorbance du radical ABTS+ est mesurée à 734 nm.
L‟activité antioxydante des échantillons est alors exprimée par la capacité antioxydante en équivalent Trolox (TEAC), définie comme la concentration de l‟étalon Trolox avec la même capacité antioxydante de l‟extrait.
II. Evaluation de l’activité antibactérienne
L‟activité antimicrobienne in vitro d‟une substance peut être mise en évidence par un grand nombre de techniques classiques, aussi bien en milieu solide qu‟en milieu liquide. Notre travail consiste à étudier l‟activité antimicrobienne des extraits de Melissa officinalis L. et
Mentha rotundifolia L. via la méthode de diffusion sur disque de papier pour déterminer le
diamètre d‟inhibition et de calculer la concentration minimale inhibitrice (CMI). II.1. Souches bactériennes
Pour testé l‟activité antibactérienne des extraits de Melissa officinalis et de Mentha
rotundifolia, six souches sensibles ont été utilisées ; dont quatre de type Gram-négatif ; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis et Enterobacter cloaceae. Et
deux de type Gram-positif ; Streptococcus pneumoniae, et Staphylococcus aureus.
Ces souches proviennent du Laboratoire de Microbiologie, Centre Hospitalier Universitaire Ibn Sina de Rabat.
II.2. Préparation de prècultures
Les souches microbiennes sont ensemencées par stries dans un milieu de gélose nutritive, après incubation 18 h à 37° C, quelques colonies bien isolées sont prélevées à l‟aide d‟une anse de platine. Ensuite, on décharge l‟anse de platine dans 10 ml d'eau physiologique stérile à 0.9 % et on homogénéise la suspension bactérienne a l'aide d'un vortex ensuite on fait des dilutions afin de standardiser la suspension bactérienne. L‟inoculum est ajusté à 0.5 Mc Farland correspondant à une densité optique de (0.08 à 0.10) à 625 nm. La concentration finale de l'inoculum est de 107 UFC/ml. (Bendahou et al., 2007)
II.3. Méthode de diffusion sur disque (aromatogramme)
La méthode des aromatogrammes est la technique choisie pour déterminer l‟activité antibactérienne des extraits des plantes, cette méthode est décrite par Jacob et Tonei, 1979. Elle consiste à utiliser des disques de papier stérile de 6 mm imprégnés des concentrations différentes des extraits. Une série de dilutions (1/1, 1/2 , 1/4, 1/8 et 1/16) de l'huile essentielle dans le Diméthylsulfoxide (DMSO) est réalisée et de l‟extrait aqueux dans l‟eau distillée. L‟agar Muller-Hinton (MH) stérile a été coulé dans des boites de pétri stériles de 9 cm. 1 ml de l‟inoculum préparé à partir de chaque souche est uniformément bien étalé à la surface de l‟agar MH. L‟excédent de l„inoculum est éliminée par aspiration (Bansod et rai, 2008). Un volume correspondant à cinquante microlitres des dilutions des extraits de l‟huile essentielle
A l‟aide d‟une pince stérile les disques sont déposés à la surface de gélose inoculée et incubée à 37° C pendant 18 heures. Après l‟incubation l‟effet des extraits se traduit par l‟apparition autour de disque d‟une zone circulaire transparente correspondant à l‟absence de la croissance. Plus le diamètre de cette zone est grand plus la souche est sensible (Choi et al, 2006). En parallèle, le DMSO et l‟eau distillée sont utilisés (témoins négatifs) afin de vérifier la croissance des différentes souches (Bekhechi et al., 2008), et comme témoin positif la Ciprofoxacine a été utilisée. L‟activité antimicrobienne a été déterminée à l‟aide d‟une règle mesurant le diamètre de la zone d‟inhibition (DZI). Le résultat est exprimé par le DZI et peut être symbolisé par des croix. non sensible (-) pour D < 8 mm; sensible (+) pour D compris 9-14 mm; très sensible (++) pour D compris 15-19 mm et extrêmement sensible (+++) pour D > 20 mm (Ponce et al., 2003).