Maturation dans des cellules transfectées (HEK293)

Nous avons choisi d’analyser dans un deuxième temps la maturation de la sPLA2-X dans des cellules HEK transfectées de façon stable. Nous avons pour cela transfecté la proPLA2-X WT humaine, proPLA2-X sauvage de souris et trois mutants du propeptide au site de clivage remplaçant l’un, l’autre ou les deux résidus basiques par une alanine (AA, KA et AR). Nous avons aussi transfecté les cellules avec une construction codant pour la sPLA2 hGX mature précédée du peptide signal de la sPLA2 hGIIA (construction pshGIIA-hGX), donc sans le propeptide de hGX. Enfin, nous avons transfecté les cellules avec le vecteur vide (Mock).

Nous avons choisi les cellules HEK293 car celles-ci n’expriment pas de sPLA2 endogènes et ont été largement utilisées pour étudier le rôle de différentes sPLA2 dont la sPLA2-X dans la libération d’acide arachidonique (37, 92, 124). Il a notamment été suggéré que la sPLA2-IIA et X pouvaient être actives soit depuis l’extérieur de la cellule ou hydrolysant la phosphatidylcholine à la membrane plasmique, soit pendant leur sécrétion en libérant de l’acide arachidonique depuis certains compartiments intracellulaires encore mal définis (124). Cependant, la maturation de la sPLA2-X n’a pas été étudiée dans ces cellules.

A partir de nos cellules transfectées, nous avons donc réalisé une série d’expérience qui a conduit aux résultats résumés ci-dessous :

1. Sur les cellules non transfectées ou Mock, l’ajout exogène des sPLA2 matures mGX et hGX pendant 6 h induit une libération d’acide arachidonique. L’ajout des formes proenzymes induit très peu de libération d’acide arachidonique. De plus, la mesure de l’activité enzymatique des surnageants cellulaires contenant les proenzymes après les 6 h d’incubation indiquent une faible activité enzymatique. Ceci montre que la conversion des proenzymes depuis l’extérieur de la cellule est lente voire nulle dans ces cellules.

2. Sur les mêmes cellules MOCK, et comme attendu, des inhibiteurs de la sPLA2-X non perméants (46) inhibent complètement l’effet des sPLA2 matures sur la libération d’acide arachidonique.

3. Sur les cellules transfectées avec les constructions promGX-WT, prohGX-WT et pshGIIA-hGX, la libération d’acide arachidonique est fortement augmentée par rapport aux cellules MOCK, et cette libération est proportionnelle au niveau d’expression des sPLA2 mesuré par TRFIA. Cette fois, les inhibiteurs sPLA2 non perméants n’ont que très peu d’effet sur la libération d’acide arachidonique, que ce soit pour les constructions pshGIIA-hGX ou pour les constructions avec les propeptides (prohGX et promGX WT). Ces résultats indiquent que la sPLA2-X est active à l’intérieur des cellules, et constituent donc un premier argument

pour dire que la coupure du propeptide permettant d’obtenir l’enzyme active s’est produite dans la cellule et pendant la sécrétion, probablement au niveau de l’appareil de Golgi.

4. Sur les cellules transfectées avec les trois formes mutées du propeptide KR -> AR, KR -> KA et KR-> AA, nous avons observé une forte libération d’acide arachidonique pour la forme AR, mais de très faibles libérations pour les deux autres formes. Nous avons vérifié par TRFIA et western-blot que les différentes cellules expriment des quantités comparables de sPLA2. Associé au point 5 ci-dessous, ces résultats indiquent que le clivage du propeptide de la sPLA2-X est nécessaire pour la libération d’acide arachidonique, et que le motif AR est suffisant pour que la protéase intracellulaire responsable de l’activation de l’enzyme coupe de façon efficace.

5. L’analyse par western-blot des lysats cellulaires et des surnageants des cellules transfectées prohGX et promGX WT montre la présence des formes proenzymes et matures dans les lysats cellulaires et seulement la présence de la forme mature dans le surnageant cellulaire. En accord avec ces résultats, l’analyse des surnageants cellulaires par immunoprécipitation puis spectrométrie de masse montre par ordre d’abondance relative :a) uniquement la présence de la forme mature pour la transfection avec la promGX-WT; b) la présence des formes mature et mipromGX pour la mutation AR; c) la présence des formes A- mGX, mipro(KA)-mGX et pro(KA)-mGX pour la mutation KA; et d) la présence à niveau égal des formes pro(AA)-mGX, mipro(AA)-mGX et AA-mGX pour la mutation AA. Ces résultats sont de nouveaux arguments en faveur d’une maturation majeure de la sPLA2-X dans les cellules pendant la sécrétion. Ils indiquent aussi que la (ou les) protéase(s) responsable(s) de cette maturation reconnaît(aissent) quasiment aussi bien le propeptide de mGX sous forme KR et AR, mais est(sont) sélective(s) pour un acide aminé basique en C- terminal du propeptide. Ces résultats indiquent aussi que la (les) protéase(s) sont capables de couper le propeptide à plusieurs sites, mais que seule la coupure au dernier résidu basique permet d’obtenir une sPLA2-X fonctionnellement active et capable de libérer de fortes quantités d’acide arachidonique.

6. Nous avons ensuite analysé l’effet de 15 inhibiteurs différents de protéases sur les cellules transfectées par les constructions promGX et prohGX WT en traitant les cellules pendant 24 h avec les inhibiteurs et en mesurant la maturation des sPLA2 par dosage enzymatique et par western-blot. Nous avons observé que seuls deux inhibiteurs de la furine et des autres proconvertases sont actifs. De façon intéressante, l’inhibiteur furin I perméant « décanoyl-RVKR-CMK » apparaît plus actif que l’inhibiteur furin II « Hexa-D-arginine » non perméant. Ces résultats suggèrent qu’une (ou plusieurs) protéase(s) de la famille furine

(une des 7 proconvertases connues) est(sont) impliquée(s) dans la maturation de la sPLA2-X dans les cellules HEK, et que cette ou ces protéase(s) agit(ssent) depuis l’intérieur des cellules.

7. Enfin, nous avons analysé l’effet de 15 inhibiteurs de protéases sur la maturation de la promGX-WT recombinante ajoutée dans le milieu de culture des cellules HEK MOCK pendant 24 h. Ces conditions permettent d’observer une faible maturation de la sPLA2-X depuis le milieu extracellulaire par une protéase sécrétée. Dans ces conditions, nous avons observé que l’activation de la proenzyme était bloquée par les deux inhibiteurs furines perméant et non perméant, mais pas par les autres inhibiteurs. Ces résultats indiquent que la(les) même(s) protéase(s) qui activent la sPLA2-X à l’intérieur de la cellule est(sont) aussi faiblement présente(s) dans le milieu de culture.

La caractérisation des sPLA2 recombinantes, leur activation par certaines protéases purifiées et les résultats résumés ci-dessus font l’objet de l’article Jemel et al. qui est en préparation et sera soumis à JBC (Journal of Biological Chemistry). Dans certains cas, des expériences complémentaires, notamment avec la sPLA2 humaine de groupe X, ont été effectuées par le Dr Hiromi Li, une jeune post-doctorante travaillant dans le laboratoire du Pr. Michael Gelb.

Article 1

Group X secreted phospholipase A

proenzyme is matured by a furin-like

convertase and releases arachidonic acid inside of mammalian HEK293

cells

Running title: intracellular proenzyme conversion of group X sPLA2

Ikram Jemel1, Hiromi Ii1, Rob Oslund, Anne-Sophie Dabert-Gay, Khaoula Chargui, Sabine Scarzello, Michael H. Gelb* and Gérard Lambeau*

Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire, Université de Nice Sophia Antipolis et Centre National de la Recherche Scientifique, Valbonne 06560, France (I.J., A.S.D.J, K.C., S.S., G.L.)

Departments of Chemistry and Biochemistry, University of Washington, Seattle, Washington 98195, USA (H.L., R.O., M.H.G.)

1

contributed equally to the work *

Corresponding authors

Abstract

Among mammalian secreted phospholipases A2 (sPLA2s), sPLA2-X has the most potent hydrolyzing activity toward phosphatidylcholine and is involved in arachidonic acid (AA) release. sPLA2-X is produced as a proenzyme and exhibits a propeptide of 11 amino acids ending with a dibasic motif, suggesting cleavage by subtilisin-like proteases. While the removal of this propeptide is clearly required for sPLA2-X enzymatic activity, the cellular location and the protease(s) involved in proenzyme conversion have remained unclear. Here, we have analyzed the maturation of sPLA2-X in HEK293 cells, which have been extensively used to analyze sPLA2-induced AA release. Using recombinant mouse (promGX) and human (prohGX) proenzymes, HEK293 cells transfected with cDNAs coding for full-length prohGX, promGX and propeptide mutants, and various permeant and non-permeant sPLA2 inhibitors and protease inhibitors, we demonstrate that sPLA2-X is essentially converted intracellularly. Most strikingly, the exogenous proenzyme does not elicit AA release while the transfected proenzyme does elicit AA release in a way insensitive to non permeant sPLA2 inhibitors. In transfected cells, a permeant furin inhibitor, but not a non permeant one nor other protease inhibitors, prevents sPLA2-X maturation and partially blocks AA release. Mutations at the dibasic motif of the propeptide indicate that a single basic residue is required but sufficient for efficient maturation and AA release. All together, these results argue for the intracellular maturation of group X proenzyme in HEK293 cells by a furin-like convertase, leading to intracellular release of AA during secretion.