Maturation dans des cellules HEK 293 transfectées

Les cellules HEK 293 sont ensemencées à 1 million de cellules par boîte de diamètre 35 mm. 24 heures après ensemencement, les cellules sont transfectées à la lipofectamine 2000.

4 µg d’ADN plasmidique (codant pour PromGX-WT, AR, KA, AA et ProhGX) sont mélangés avec 10 µl de lipofectamine 2000, incubés pendant 30 min à température ambiante dans du milieu DMEM, sans sérum et sans antibiotique, puis ajoutés aux cellules fraîchement lavées avec du DMEM/10% sérum.

Après 48 h d’incubation à 37°C, les surnageants cellulaires sont récupérés, les cellules sont dissociées et ensemencées dans des boîtes de diamètre de 150 mm afin de sélectionner les clones stables en présence de 0,4 mg/ml de zéocine. Les différents clones ont été isolés par la technique des « confettis » qui consiste à dissocier les colonies avec des disques de papier filtre préalablement trempés dans une solution de dissociation trypsine-EDTA. Le niveau d’expression des clones est analysé par mesure de l’activité sPLA2 et TRFIA.

b) Dosage d’activité sPLA2

Synthèse du substrat : la mesure de l’activité enzymatique sPLA2 sur les membranes d’E.coli consiste à mesurer la capacité des sPLA2 à libérer l’acide oléique tritié préalablement incorporé dans les phospholipides (83). Les membranes d’E.coli marquées à l’acide oléique ont été préparées de la façon suivante : 1 ml d’une culture saturée de bactérie E.coli XL1 a été dilué dans 75 ml de milieu LB contenant 500 µCi [3H]-oléate et la culture bactérienne est incubée pendant 4 heures à 37°C. Les bactéries sont centrifugées, resuspendues dans 50 ml de milieu LB et remises en culture à 37°C pendant 30 minutes pour éliminer l’acide oléique non incorporé. Après centrifugation, le culot cellulaire est lavé avec 1 ml de 0,1 M Tris/HCl pH 8.0; 1 mM EDTA et 0,5% BSA délipidée (fatty acid free BSA, FAF, sigma), à nouveau centrifugé puis resuspendu dans 2 ml de 0,1 M Tris/HCl pH 8.0; 1 mM EDTA. La suspension est autoclavée (120°C, 15 min), lavée par centrifugation et stockée en aliquots à -20°C. mesure de l’activité sPLA2 : la mesure d’activité enzymatique des sPLA2 est effectuée à température ambiante, pendant des temps d’incubation variables (5 min à 1 heure) dans 300 µl de tampon d’activité (0,1 M Tris/HCl pH 8.0; 10 mM CaCl2; 0,1% BSA) contenant environ 100000 dpm de membranes radiomarquées. Les réactions sont arrêtées par l’addition de 300 µl de tampon stop (0,1 M EDTA; 0,2% BSA FAF), centrifugées à 14000 rpm pendant 5 min et les surnageants contenant l’oléate radiomarqué libéré sont comptés.

c) Western blot

Le surnageant concentré de cellules transfectées ou les lysats cellulaires sont dilués dans le tampon de Laemmli supplémenté en β-mercaptoéthanol puis chauffés à 95°C pendant 10 min. Les protéines sont séparées par électrophorèse sur un gel de SDS_polyacrylamide 14%. Le transfert du gel sur membranes de polyvinylidene fluoride (PVDF) est effectué en présence de 25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% éthanol pH 8.5. La membrane est ensuite bloquée sur la nuit dans du NETG (150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl pH 7,4; 0,05% Triton X-100, 0,25% gélatine), et incubée pendant 1 h avec le sérum polyclonal de

lapin dirigé contre mGX (1/1000 dans NETG). Les membranes sont ensuite lavées dans le NETG puis incubées en présence d’anticorps secondaires couplés à la peroxydase (1/10000 dans NETG). L’activité de la peroxydase est révélée par l’ajout du réactif ECL (Enhanced

Chemiluminescence Substrate ECL, Pierce). d) Immunoprécipitation

Les surnageants ou les lysats cellulaires (lyse faite dans un tampon RIPA : 10 mM Tris/HCl pH 7,4; 1% Triton X-100; 0,25% DOC; 0,1% SDS; 150 mM NaCl; 5 mM NaF en présence d’inhibiteur de protéases) sont incubés pendant 4 h à 4°C et sous agitation en présence de 15 µl d’anticorps polyclonal dirigé contre la sPLA2-X mature de souris puis incubés pendant 16 h à 4°C en présence de 30 µl de protéine A-Sépharose. Le complexe immun est isolé par centrifugation pendant 10 min à 14000 rpm à 4°C, lavé à 4°C avec du PBS-tween 0,1%. Les échantillons sont analysés par Western-blot et spectrométrie de masse.

e) TR-FIA

A l’aide de l’anticorps polyclonal dirigé contre la sPLA2-X mature de souris, nous avons pu mettre au point un test de dosage quantitatif et très sensible de la sPLA2-X par TR- FIA (Time-resolved fluoroimmunoassay) (Figure 7) en suivant la méthode initialement développé par Eerola et al.(100). Cette méthode est environ 1000 fois plus sensible que la technique de western-blot, et permet de détecter moins de 5 pg de sPLA2-X (100). Du fait de l’anticorps utilisé, il faut noter que cette méthode détecte aussi bien la forme mature que la forme proenzyme de la sPLA2-X.

Les plaques de microtitration (Delfia yellow plate ref AAAND-0001) sont incubées sur la nuit avec 1 µ g d’IgG totales de lapin dirigées contre la sPLA2-X mature (Les IgG ont été prépurifiées sur protéine A) diluées dans 100 µl de tampon 0,1 M phosphate de sodium pH 4,9. Chaque puits est ensuite saturé par un tampon de blocage (0,9% NaCl; 0,05 M Tris/HCl pH 7,8; 0,05% NaN3; 6% D-sorbitol; 1% BSA; 1 mM CaCl2) pendant 2 h à température ambiante et sous atmosphère humidifiée par une solution TSA (Tris-saline-azide, 50 mM Tris/HCl pH 7,8; 0,9% NaCl; 0,05% NaN3) puis lavé avec le tampon de rinçage (0,9% NaCl; 0,02% Tween 20; 0,05 M Tris/HCl pH 7,8; 0,05% NaN3). Les extraits protéiques à doser, préalablement quantifiés par un dosage de protéine (277), sont dilués dans le tampon « Assay buffer » 0,9% NaCl; 0,05 M Tris/HCl pH 7,8; 0,05% NaN3; 0,5% BSA; 0,01% Tween 40; 20 µM DTPA (diethylenetriaminepentaacetic acid) et incubés pendant 1 h à température ambiante. Les puits sont ensuite lavés trois fois avec le tampon de rinçage. Ils sont ensuite incubés pendant 1 h avec 100 µl d’une solution à 0,1 µg/ml des mêmes IgG de lapin, mais préalablement marqués à l’europium (kit de marquage Delfia Perkin Elmer #1244-302).

Après lavage, la révélation se fait par ajout de l’Enhancement Solution (Perkin Elmer #1244- 105) qui va permettre de libérer l’europium chélaté lié aux anticorps marqués. Après 10 minutes de réaction, la fluorescence de l’europium est lue avec un lecteur de microplaque à fluorescence en temps résolu (modèle Envision Perkin Elmer).

Figure 7: Principe de la technique de TR-FIA (Time-Resolved Fluoroimmunassay). Dans notre cas,

les anticorps spécifiques de la sPLA2 sont adsorbés sur la phase solide à la place de la protéine X, les sPLA2 et les anticorps marqués à l’europium forment un complexe. L’europium chélaté devient très fluorescent ce qui donne un dosage sensible des sPLA2.

f) Analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF

Les analyses par spectrométrie de masse ont été réalisées par les Dr. Sabine Scarzello et Anne-Sophie Dabert-Gay au sein du plateau de protéomique de l’institut. Dans la plupart des cas, les échantillons fournis ont été dessalés par purification en phase solide sur support Zip-Tip C18 (Millipore) en suivant le protocole du fabricant et en éluant la sPLA2 avec une

solution H2O/ACN/TFA (20/80/0,1). La sPLA2 éluée est co-cristallisée avec la matrice organique (acide sinnapinique) sur des plaques d’analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight) et les mesures sont effectuées en utilisant une méthode optimisée pour la mesure de masse moléculaire des sPLA2 (36).

g) Profil d’inhibition de la maturation dans les clones stables des cellules HEK

Les clones des cellules HEK-293 PromGX-WT, et ProhGX sont ensemencées en plaques 48 puits (28.000 cellules/puits) et incubées pendant quatre jours en milieu complet en présence de 0,2 mg/ml de zéocine. Les cellules sous-confluentes sont ensuite lavées en milieu DMEM sans sérum et incubées pendant 24 heures dans du milieu DMEM supplémenté avec 0,02% BSA FAF et différents inhibiteurs spécifiques des protéases (orthophenanthroline, bathophenanthroline, deux inhibiteurs spécifiques de la furine : hexa-R et Décanoyl-RVKR- CMK, antipaine, alpha1-PDX, chymostatine, E64, leupeptine, pepstatine, phosphoramidon, pefabloc, aprotinine, complete et STI). Les surnageants et les lysats cellulaires sont ensuite récupérés pour dosage d’activité PLA2.

h) Prolifération cellulaire par incorporation de la thymidine tritiée

Les cellules HEK-293 (5000 cellules/puits) sont ensemencées en plaques 48 puits et incubées pendant 72 heures en milieu complet. Les cellules sont ensuite lavées en milieu sans sérum et rendues quiescentes par incubation pendant 24 heures dans du milieu sans sérum supplémenté avec 0,02% BSA FAF. Les cellules sont ensuite traitées en triplicat avec les différents effecteurs dans 200 µl de milieu sans sérum contenant 0,02% BSA FAF et incubées 24h à 37°C. Pendant les 4 dernières heures d’incubation, les cellules sont traitées avec un mélange de [3H]-thymidine/thymidine froide (1µ M, 1µCi/ml). Chaque puits est ensuite lavé 2 fois avec du PBS et incubé pendant 30 min dans de l’acide trichloroacétique 10% froid. Les cellules sont lysées dans NaOH 0,2 N, les lysats sont récupérés et comptés après ajout de liquide scintillant afin de déterminer le taux d’incorporation de [3H]-thymidine dans l’ADN cellulaire.

i) Libération d’acide arachidonique

Les HEK-293 sont ensemencées à 5000 cellules par puits en plaque 48 puits pendant 72h, puis incubées pendant 24 h dans du milieu complet (DMEM/10% sérum) avec 0,1 µCi/puits d’acide arachidonique tritié (Perkin Elmer). Les cellules sont lavées deux fois avec du DMEM complet et incubées pendant 6 heures en présence des sPLA2 ou autres effecteurs. Le surnageant est récupéré, centrifugé à 14000 rpm pendant 5 min et compté en présence de liquide scintillant. Les cellules sont aussi récupérées et comptées pour déterminer le

pourcentage d’acide arachidonique libéré dans le milieu par rapport à la quantité incorporé (%=100*dpm (sgt)/dpm (sgt) +dpm (lysat)).

1.3 Maturation des protéines recombinantes par différents surnagents