Présenté par MAHOUNON Véronique A. Leaticia 19 Dans cette partie, la méthodologie de la recherche, le matériel biologique, les protocoles expérimentaux et les méthodes analytiques utilisés pour atteindre les objectifs visés sont présentés.
1-Matériel
Le matériel utilisé dans la présente étude est constitué du matériel biologique (Trachurus trachurus) et des appareillages de diagnostic biologique.
1-1- Matériel biologique
Le matériel biologique utilisé dans cette étude est constitué de du poisson. Il s’agit de Trachurus trachurus, collectées dans quelques poissonneries de l’arrondissement de Sékou.
1-2- Matériel de diagnostic biologique
Le matériel de diagnostic biologique est constitué de la verrerie classique (pipettes, erlenmeyers, tubes à essais) des boites de Pétri à usage unique stériles de 90mm de diamètre, d’une micropipette P100 marque Gilson, des milieux de cultures. Les milieux de culture et réactifs utilisés dans le diagnostic microbiologique proviennent de MERCK, 64271 Darmstadt, Germany, OXOID, BASINGSTORE, Hampshire, England, de BIOMERIEUX, 69280 Marcy l’Etoile, France.
2-Méthodologie
La méthodologie suivie dans la réalisation de la présente étude peut être regroupée en deux étapes principales. La première étape a consisté à l’échantillonnage des poissons congelés dans les principales poissonneries ayant de grandes affluences, après avoir effectué une collecte d’information sur les types de poissons vendus dans les poissonneries de l’arrondissement de Sékou, afin d’identifier les espèces les plus appréciées par la population et qui feront l’objet de l’étude. Au total trois
Présenté par MAHOUNON Véronique A. Leaticia 20 séries d’échantillonnage a été effectuée en tenant compte de la périodicité des jours de marché. La seconde étape a consisté à évaluer la qualité microbiologique des poissons congelés collectés.
2.1. Collecte des poissons
Les échantillons de poissons utilisés dans l’étude ont été collectés directement au niveau des poissonneries. La collecte a été effectuée dans les conditions de vente habituelle et mis sous glace dans des glacières. Ensuite les échantillons ont été amenés au Laboratoire pour analyse.
2.2. Evaluation de la qualité microbiologique des poissons
Les analyses microbiologiques ont porté sur la recherche et le dénombrement de la flore aérobie mésophile totale (FAMT), des coliformes totaux et fécaux, des staphylocoques présumés pathogènes, des Anaérobies Sulfito-Réducteurs, les levures et moisissures et Salmonella spp.
Réalisation de la suspension mère et des dilutions décimales NF V08-010 (AFNOR, 1996)
La préparation de la suspension mère et les dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique a été réalisée selon la norme NFV08-010. En effet, une prise d’essai de 25 g de l’échantillon du poisson a été réalisée dans l’erlenmeyer stérile puis additionnée de 225 ml d’eau peptonnée tamponnée (OXOID CM 0509 Basingstoke Hampshire, England). L’ensemble a été homogénéisé pour obtenir la suspension mère qui a servi à la préparation des dilutions décimales.
Dénombrement de la flore aérobie mésophile totale NF V008-011 (AFNOR, 1996)
Le dénombrement de la flore totale a été réalisé selon la norme NF V008-011. Le milieu utilisé est le Plate Count Agar (OXOID CM 0463, Basingstoke, Hampshire, England). Un millilitre de la dilution 10-1 a été prélevé et ensemencé
Présenté par MAHOUNON Véronique A. Leaticia 21 sur le milieu Plate Count Agar (PCA) précoulé dans une boîte de Pétri stérile puis recouverte d’une seconde couche de gélose formant ainsi une double couche. Les colonies formées sont dénombrées après 72h d’incubation à 30°C.
Dénombrement des coliformes NF V 08-054/ NF V 08-060 (AFNOR, 1996)
Le dénombrement des coliformes s’est fait conformément à la norme NF V 08-054 pour les coliformes totaux, et la norme NF V 08-060 pour les coliformes fécaux ou thermo-tolérants. L’ensemencement est fait sur le milieu Violet Red Bile Agar (BIOKAR Diagnostics BK 152 HA, ZAC DE THER-ALLANE-F 6000 BEAUVAIS). Les boîtes sont incubées à 37oC, pendant 24h pour le dénombrement des coliformes totaux et à 44oC pendant 24h pour le dénombrement des coliformes fécaux. Les colonies caractéristiques rouges violacées d’un diamètre de 0.5-1 mm avec ou sans halo de précipité de sel biliaires sont dénombrées en profondeur de la masse de gélose.
Dénombrement des staphylocoques présumés pathogènes NF ISO 6888 (AFNOR, 1996)
La recherche et le dénombrement des staphylocoques présumés pathogènes a été réalisé selon la norme NF ISO 6888, en utilisant le milieu Baird Parker (OXOID CM 0275, Basingstoke, Hampshire, England). L’ensemencement a été fait avec 0,1 ml de la suspension mère. Après 48h d’incubation à 37oC les colonies typiques (colonies noirâtres entourées d’un halo clair) sont dénombrées.
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Dénombrement des levures et moisissures NFV 08-059 (AFNOR, 1996)
La recherche et le dénombrement des levures et moisissures ont été réalisés selon la norme NFV 08-059 en utilisant le milieu sabouraud au Chloramphénicol.
L’ensemencement a été fait en surface avec 0,1 ml de la dilution 10-1. Les colonies formées sont dénombrées après 5 jours d’incubation à 30 °C.
Recherche des anaérobies sulfito-réducteurs AFNOR NF V 08-019/ISO 7937
Le dénombrement des germes est réalisé selon la norme AFNOR NF V 08-019/ISO 7937 sur le milieu Tryptone Sulfite Néomycine (BIOKAR Diagnostics BK 001 HA, ZAC DE THER-ALLONE-F 6000 BEAUVAIS). 1 ml de la dilution 10-1 est prélevé dans deux tubes, puis ces tubes sont soumis à un chauffage à 80°C pendant 10 minutes dans le but d’éliminer les formes végétatives et de garder uniquement les formes sporulées. Après un refroidissement on ajoute environ 9 ml de gélose TSN prête à l’emploi, dans chacun des tubes. On laisse refroidir sur la paillasse pendant 30 minutes et ces tubes sont incubés à 37°C pendant 48 heures. L’apparition de colonies noires dans les tubes révèle la présence d’Anaérobies Sulfito-Réducteurs.
Recherche des salmonelles (NF EN ISO 6579) Elle s’est faite en six (06) étapes :
Pré enrichissement
Le pré enrichissement a été fait en diluant 25g de l’échantillon de salade dans 225g d’EPT (pour la revivification). Après homogénéisation, l’incubation a été réalisée à 37°C pendant 18h±2h.
Enrichissement
Nous avons ensemencé 0,1mL du bouillon pré-enrichi dans 10mL de bouillon
Présenté par MAHOUNON Véronique A. Leaticia 23 Rappaport Vassiliadis et nous avons incubé à 41,5°C pendant 21h±3h.
Parallèlement nous avons ensemencé 2mL du bouillon pré-enrichi dans 20mL de bouillon Müller Kaüffmann et incubé à 37°C pendant 21h±3h.
Isolement sélectif
Une œse de chacun des bouillons enrichis a été ensemencée par stries respectivement sur les géloses XLD et Hecktoen. L’incubation s’est effectuée à 37°C pendant 21h±3h. Les colonies suspectes de salmonelles sur XLD sont de couleur rouge avec ou sans centre noir et sur Hecktoen, elles sont de couleur verte avec ou sans centre noir.
Recherche de l’Uréase ou test de discrimination
La moitié d’une colonie suspecte isolée sur XLD ou Hecktoen a été émulsionnée dans un tube à hémolyse contenant environ 3ml de bouillon urée-indole.
L’incubation a été réalisée à 37°C pendant 4 à 24h. Les salmonelles étant uréase négative, seules les colonies ayant donnée un résultat négatif ont été retenues pour la suite des tests. Le résultat positif s’est manifesté par l’apparition d’une coloration rose ou rouge.
Purification
La seconde moitié de la colonie uréase négative a été ensemencée sur une plaque de gélose nutritive. L’incubation s’est faite à 37°C pendant 21h±3h.
Identification biochimique
Elle a consisté à rechercher un certain nombre de paramètres sur le portoir réduit et à faire la galerie API 20E.
2.2. Analyses statistiques
Les analyses ont été faites en triplicata. Les données ont été traitées à l’aide des logiciels Microsoft Excel 2007 et SPSS 16.0. Le logiciel SPSS 16.0 a servi à l’analyse statistique des données pour la comparaison des moyennes à l’aide du Test-t pour échantillons indépendants et pour l’analyse de la variance par les test
Présenté par MAHOUNON Véronique A. Leaticia 24 de Duncan et de Dunnett. Une probabilité inférieure à 0,05 fut considérée comme étant significative.
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