Chapitre 3: Matériels et méthodes
3.1. Matériels
3.1.1. Laits
Les laits de vache, de brebis ou de chèvre utilisés durant la thèse correspondent à des laits entiers
crus de grand mélange qui ont été produits dans la région Bretagne. Le lait bovin a été fourni par
la société Entremont (Montauban de Bretagne, France). Les laits de brebis et de chèvre ont été
fournis par la société Triballat (Noyal-sur-Vilaine, France). De l'azide de sodium (NaN3, 0,02% p
/v) a été ajouté aux différents laits pour empêcher la croissance des bactéries.
Les analyses de la teneur en lipides totaux et de composition en lipides polaires et en cholestérol
réalisées sur ces laits sont détaillées dans l’article Et-Thakafy et al. (2017), Food Chemistry, 220,
352-361 (voir chapitre 4 de la thèse).
A partir de laits de vache de grand mélange fournis par la ferme laitière de Pacé (France), des
globules gras lavés ont été préparés ; le protocole de préparation de ces échantillons est détaillé
dans le chapitre 8.
3.1.2. Lipides polaires
3.1.2.1. Glycérophospholipides: DOPC et DPPC
Nous avons choisi d’utiliser deux glycérophospholipides synthétiques de structures différentes
(Figure 28) :
- un insaturé qui est en phase fluide à température ambiante: le
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine insaturé (DOPC ; 18:1n-9/18:1n-9; pureté > 99%)
- un saturé qui est en phase gel à température ambiante : le
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine saturé (DPPC ; 16:0 /16:0; pureté > 99%).
Il s’agit de phospholipides zwitterioniques de même tête polaire phosphatidylcholine (PC), avec
deux chaînes carbonées symétriques, mais de degré d’insaturation différent (Figure 28). Leur
longueur de chaînes est également légèrement différente (2 atomes de carbone). Ils ont été achetés
chez Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA).
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Figure 28: Structures chimiques des molécules de DOPC et de DPPC
3.1.2.2. Sphingomyéline de lait et sphingomyélines individuelles
Des sphingomyélines (SM) ont été utilisées durant le travail de thèse pour étudier leurs propriétés
physiques lorsqu’elles sont organisées en bicouches hydratées.
La sphingomyéline provenant du lait bovin (milk SM, poudre, pureté > 99%) a été achetée chez
Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). La milk SM est un mélange naturel complexe constitué
de différentes espèces moléculaires, caractérisées par différentes chaînes acyl et bases sphingoides
(Figure 29). La majorité (~ 44% en masse) de la base sphingoide à longue chaîne est composée de
18 atomes de carbone dotée d’une double liaison trans. La milk SM contient également des acides
gras dont la longueur varie entre 16 et 24 atomes de carbone avec environ 20% (w/w) de C16: 0,
C22: 0 ou C24: 0 et ~30% (w/w) de C23:0 (Byrdwell and Perry, 2007; Fong et al., 2007).
Des molécules synthétiques de SM, achetées en poudre chez Avanti Polar Lipids, ont également
été utilisées. Nous avons choisi des SMs de structures différentes correspondant aux espèces
moléculaires majoritaires trouvées dans la milk SM, afin de pouvoir réduire la complexité du
mélange naturel de la milk SM et de comprendre l’effet de l’hétérogénéité de composition sur les
propriétés mécaniques des liposomes. Les espèces moléculaires de SM choisies sont la
palmitoyl-D-érythro-sphingosylphosphorylcholine (d18:1/16:0; C16:0-SM, pureté > 99%), la
N-lignoceroyl-D-érythro-sphingosylphosphorylcholine (d18:1/24:0; C24:0-SM, pureté > 99%) et la
N-nervonoyl-D-érythro-sphingosylphosphorylcholine (d18:1/24:1; C24:1-SM, pureté > 99%).
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Figure 29: A) Distribution des bases sphingoides et des acides gras de la sphingomyéline du lait (milk SM) ; B) Structure chimique des molécules de SMs individuelles
3.1.2.3. Cholestérol
Des molécules de cholestérol (chol) extraites de la laine ovine (poudre, pureté > 98%) ont été
achetées chez Avanti Polar Lipids. La structure est montrée sur la Figure 30.
Figure 30: Structure chimique de la molécule de cholestérol
3.1.2.4. Lipides polaires extraits de la membrane des globules gras du lait
Un mélange complexe de lipides polaires de la membrane du globule gras du lait a été utilisé au
cours de la thèse. Ce mélange de lipides polaires laitiers correspond au produit référencé PC 700
et acheté à la société Fonterra (Nouvelle Zélande), qui a ensuite été diafiltré au laboratoire pour
augmenter sa pureté en éliminant le lactose et des minéraux. Il s’agit du même extrait de lipides
polaires laitiers que celui utilisé dans les articles (Murthy et al., 2016a, 2016b). Les 5 classes
majeures de lipides polaires contenus dans cet extrait, avec leur pourcentage en poids, sont la
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sphingomyéline du lait (milk SM, 38.7%), la phosphatidylcholine (PC, 31.6%), la
phosphatidylethanolamine (PE, 23.5%), la phosphatidylinositol (PI, 3.4%) et la phosphatidylsérine
(PS, 2.8%), comme déterminé par HPLC (données internes à l’UMR STLO ; voir section 3.2.2.2).
La composition en acides gras de l’extrait de lipides polaires de la membrane des globules gras est
présentée dans la Figure 31, en couleur orange. Les acides gras à chaînes très longues et saturées
(C22:0, C23:0, C24:0) proviennent de la quantité élevée de milk SM dans l’extrait de lipides
polaires de la membrane des globules gras du lait (montrée en gris sur la Figure 31).
Figure 31: Composition en acides gras de l’extrait de lipides polaires de la membrane des globules gras du lait (en orange) et de la sphingomyéline du lait (en gris) (données internes à l’UMR STLO, C. Lopez).
3.1.3. Autres matériels
3.1.3.1. Tampons
Deux types de tampons ont été utilisés durant la thèse :
- Le tampon PIPES a été préparé en dissolvant 10 mM de PIPES (acide1,4-pipérazine-éthane
sulfonique, pureté ≥ 99%, Sigma Aldrich, USA), 50 mM de NaCl (chlorure de sodium, pureté ≥
99%, Sigma Aldrich, USA), et 2,5 ou 10 mM du CaCl2 (chlorure de calcium, pureté ≥ 99%, Sigma
Aldrich, USA) dans une solution basique de 5 M NaOH (hydroxyde de sodium, pureté ≥ 97%,
Carlo Erba, Italie). Le mélange a été agité pendant 30 min en utilisant un agitateur magnétique
chauffant à 50°C puis de l’eau distillée Milli-Q a été ajoutée pour obtenir la concentration finale
souhaitée. Le pH a été ensuite ajusté en utilisant du NaOH 5 M afin d’atteindre pH 6.7, qui
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correspond au pH du lait. Le tampon PIPES préparé non filtré a été stocké à 4°C et remis à
température ambiante avant chaque expérimentation.
- Le tampon PBS (Phosphate buffered saline / tampon phosphate salin) est composé de 0.014 M
de KH2PO4 (dihydrogénophosphate de potassium, pureté ≥ 99%, Merck, France), 0.2 M de
Na2HPO4 (hydrogénophosphate de sodium, pureté ≥ 98%, Panreac, Espagne), 1.36 M de NaCl
(chlorure de sodium Panreac, pureté ≥ 99%, Carlo Erba, Italie) et 0.02 M de KCl (chlorure de
sodium, pureté ≥ 99%, Sigma Aldrich, USA). Ces molécules ont été dissoutes dans de l’eau
distillée. Le tampon a été initialement préparé à pH 7.4 puis ajusté à pH 6.7 en utilisant quelques
gouttes d’HCl (acide chlorhydrique 37%, VRW international, Fontenay-sous-Bois, France).
3.1.3.2. Solvants organiques
Les solvants utilisés sont de qualité analytique. Il s’agit de l’éthanol (Alcogroup, Paris, France),
l’éthanol absolu (VRW international, Fontenay-sous-Bois, France), le méthanol, le chloroforme,
et l’isopropanol qui ont été fournis par Carlo Erba (Paris, France).
3.1.3.3. Substrats utilisés pour la microscopie à force atomique
En vue de la caractérisation par AFM, nous avons testé différents substrats qui ont servi de support
pour immobiliser les bicouches lipidiques (planes ou liposomes):
- Mica muscovite rubis clair fourni en plaques (Good fellow, Lille, France),
- Silice /wafer de silicium d’orientation atomique 100 (Siltronix, Archamps, France),
- Lames de verre de diagnostic (Thermo Scientific, Waltham, USA),
- Des substrats de verre revêtus par une fine couche d’or (Platypus Technologies, Madison,
WI, USA). Dans certains cas, les substrats d’or ont été traités chimiquement pour greffer
des chaines carboxyles à la surface. Pour cela, les substrats ont été mis, pendant 24 heures
minimum, dans une solution composée de 2 mM de MUA (acide
11-mercaptoundecanoïque, 95%, Sigma Aldrich, USA) dissous dans de l’éthanol absolu, puis
rincés à l’éthanol absolu puis à l’eau déionisée.
- Les petits morceaux de substrats d’or, de silice ou du mica ont été collés sur les lames de
verre de diagnostic en préalable 4 jours avant l’utilisation afin que la résine (Super Attack
Loctite, fournisseur, Belgique) soit bien polymérisée et séchée.
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