support pour l’indentation par AFM
La caractérisation des propriétés mécaniques des vésicules par AFM nécessite de les
immobiliser sur une surface (ou « substrat ») afin de pouvoir les indenter. L’immobilisation des
vésicules dépend de la composition lipidique, de la taille, de la charge des vésicules, de la
température, et de la nature de la surface (Serro et al., 2012; Takechi-Haraya et al., 2016). Nous
avons donc testé plusieurs surfaces en fixant préalablement la composition (vésicules de milk SM)
et l’environnement (tampon PIPES-NaCl à 10 mM CaCl2 ; pH 6.7 ; 20°C). Notre choix cible une
immobilisation maximale des vésicules tout en minimisant leur déformation lors de l’adsorption.
Nous avons testé 5 substrats différents :
• Verre nettoyé à l’éthanol absolu puis à l’eau déionisée (fragment de lame porte-objet en verre
sodocalcique, RS France, Wissous)
• Verre nettoyé à l’éthanol absolu, à l’eau déionisée puis par traitement UV/ozone pendant 10 min
• Or (verre revêtu par une couche mince d’or, AU 0500 ALSI, Platypus Technologies, Madison,
WI, USA) nettoyé à l’éthanol, à l’eau distillée puis par traitement UV/ozone pendant 10 min
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• Or (verre revêtu par une couche mince d’or) greffé avec des chaines de carboxyles qu’on obtient
en immergeant les substrats d’or dans une solution composée de 2 mM de MUA (acide
11-mercaptoundécanoïque
)dissous dans l’éthanol absolu. L’incubation dure 48h à 5°C ; puis les
substrats sont rincés avec de l’éthanol absolu, puis à l’eau déionisée.
• Silice nettoyée à l’éthanol absolu puis à l’eau déionisée, puis par traitement UV/ozone pendant 10
min
Le mica, qui est un support très courant pour l’immobilisation d’objets en microscopie AFM, a été
rapidement écarté. En effet, les vésicules se déformaient significativement à l’adsorption,
probablement en raison la forte densité de charge du mica et/ou du pontage ionique entre le mica
hydrophile, appauvri en potassium, et les têtes de PC rendues électropositives par le calcium.
Pourtant, Laney et al., (1997) ou Liang et al., (2004a) ont pu utiliser du mica pour immobiliser
des vésicules, mais leurs conditions étaient différentes (présence de protéines membranaires ou
absence d’ions dans le milieu, respectivement). Par ailleurs, la planéité parfaite du mica n’était pas
requise pour l’immobilisation d’objets très saillants comme les vésicules, dont on n’indenterait
que le sommet.
L’immobilisation des vésicules a été caractérisée à l’aide de la microscopie confocale et de l’AFM.
Dans un premier temps, nous avons observé l’adsorption et la présence des vésicules sur les
différents surfaces en utilisant la microscopie confocale. Nous avons préparé des cellules avec un
petit montage qui permet de visualiser la surface des substrats (Figure 56). Ces cellules sont
composées d’une lame de diagnostic à cadre hydrophobe, le substrat (silice, verre, or…) collé au
centre d’un puits et sur lequel est déposée la suspension de vésicules, et des espaceurs (quelques
mm d’épaisseur) disposés de chaque côté du puits. La suspension de vésicules, marquée avec du
rouge de Nile, a été déposé directement sur la surface étudiée. La cellule a été ensuite couverte par
une lamelle couvre-objet (épaisseur ~150 µm, RS France) afin de piéger la suspension entre les
deux surfaces par capillarité. La hauteur des cellules, qui dépend des espaceurs, devait établir une
distance entre l’oculaire et la surface du substrat de 300 µm maximum (maximum de la profondeur
de champ de l’objectif). La cellule a ensuite été disposée à l’envers sur la platine du microscope
inversé, afin que la surface des substrats soit exposée au faisceau, à travers la fine lame de verre.
Si elle avait été disposée à l’endroit, l’épaisseur du fond de la cellule et l’opacité de certains
substrats n’auraient pas permis d’accéder à la surface d’intérêt. Pour visualiser les vésicules, le
faisceau était d’abord focalisé sur la surface interne de la lame fine, puis on se déplaçait en hauteur
dans le volume, où des vésicules mobiles pouvaient être vues, jusqu’à atteindre la surface du
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substrat, supposée être dense en vésicules immobiles. Une fois cette surface dépassée, la
focalisation étant dans la masse du substrat où plus aucune fluorescence n’était observable, ce qui
constituait un autre repère pour se placer exactement au niveau de la surface du substrat.
Figure 56: Schéma représentatif du montage de la cellule utilisée en microscopie confocale, avec les différentes surfaces verre, silice et or.
Dans un deuxième temps, nous avons examiné la stabilité des vésicules adsorbées par AFM. Les
images en force volume ont été acquises sur les mêmes échantillons que ceux utilisés en
microscopie confocale, après ouverture de la cellule. Nous avons utilisé une sonde MSNL 0.03
N.m
-1(Bruker, Santa Barbara, CA, USA), calibrée extemporanément par la méthode du bruit de
fond thermique, qui se déplaçait avec une vitesse de 2 μm.s
-1. La force appliquée était de l’ordre
de 0.5 nN pour éviter d’endommager les vésicules. Les champs scannés avaient des dimensions
variant de 20 × 20 μm
2à 3 × 3 µm
2. Ainsi, nous avons pu tester la force d’adsorption et
l’immobilisation des vésicules lors du passage de la sonde, le mode force-volume permettant
d’éviter d’exercer une contrainte latérale sur les objets. Cette expérience a permis également
d’estimer la déformation que les vésicules ont subie suite à l’adsorption (Dimitrievski and Kasemo,
2008; Liang et al., 2004b). En utilisant la hauteur H de la vésicule et son diamètre W à la base,
qu’on a pu extraire à partir des images, on peut calculer l’angle E» de mouillage à l’aide de
l’équation (Helstad et al., 2007) :
124
𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 L 𝞰c𝞰o𝞰s
? 5l s F 9* p𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 : 𝞰 𝞰éMQ=PEKJ𝞰 t v 𝞰 ; 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰 𝞰
Les résultats de la caractérisation par microscopie confocale et AFM sont présentés dans le
Tableau 3 ci-dessous :
Tableau 3 : Caractérisation de l’adsorption et de la stabilité des vésicules sur cinq différents substrats
En se basant sur ces résultats, nous avons pu comparer les surfaces en termes de densité, de
déformation, et de stabilité de l’immobilisation au passage de la pointe:
✓
La densité: une bonne présence des vésicules a été observée sur toutes les surfaces en utilisant
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✓
La déformation : Le calcul de l’angle E» nous a permis de déterminer l’effet de l’adsorption sur
la forme des vésicules en fonction de la surface. Avec un angle E» =80°, on constate que le verre
nu ne déformait pratiquement pas les vésicules (compte-tenu de l’angle de la pointe AFM, qui est
de 15 à 25° selon les côtés, et de l’effet de la convolution). Sur les autres surfaces, l’angle de
mouillage est généralement situé entre 50° et 66°, ce qui correspond à une déformation des
vésicules sous la forme d’une calotte sphérique (Colas et al., 2007; Liang et al., 2004b).
✓
La stabilité/l’immobilisation: Malgré la réalisation de quelques images en force-volume par
AFM, il a été expérimentalement difficile d’acquérir des images des vésicules adsorbées sur du
verre. Sur cette surface, les vésicules qui sont peu déformées et donc probablement faiblement
adsorbées, avaient toujours tendance à se déplacer avant que l’image soit complète. Au contraire,
sur les autres surfaces, il était possible de réaliser plusieurs images sur le même champ sans faire
bouger les vésicules. A partir de ces observations, nous avons déduit que la surface du verre (nu
ou nettoyée aux UV) ne permet pas une immobilisation optimale des vésicules. En comparant
ensuite l’or et la silice, nous avons constaté que les vésicules étaient plus stables sur la silice, en
cohérence avec leur déformation légèrement plus élevée à l’adsorption. L’immobilisation sur la
silice a également réussi pour d’autres types de vésicules comme des SUV de
dipalmitoylphosphatidylcholine (Delorme and Fery, 2006).
En conclusion, nous avons opté pour des surfaces de silice lors de nos travaux sur
l’étude des propriétés mécaniques des SUV par indentation en microscopie AFM.
Dans le document
Hétérogénéité des membranes lipidiques et propriétés mécaniques : des bicouches modèles aux membranes des globules gras du lait
(Page 124-128)