Matériels et méthodes 1. Solvants

Le tableau suivant indique les solvants et réactifs utilisés qui ont nécessité des conditions propres de purification et de conservation.

DMF Distillé sur ninhydrine

Tétrachlorure de carbone Distillé sur P2O5, conservé sur tamis moléculaire 4 ^Å

TEA Distillé sur KOH

Chloroforme Distillé sur P2O5, conservé sur tamis moléculaire 4 ^Å Tous les solvants utilisés ne contiennent pas plus de 10 ppm d’eau.

A. 2. Chromatographie sur plaque

Les Chromatographies sur couche mince (CCM) sont réalisées sur plaques d’aluminium recouvertes de silice, Merck Silicagel 60 F254 5554. Les plaques sont soumises à l’élution dans des cuves closes. Les spots sont lus sous lampe UV, Vilber-Lourmat, CN-6, à 254 nm ou 365 nm. Selon la nature des produits, les spots sont révélés par chauffage précédé d’une pulvérisation d’une solution à 10 % d’acide perchlorique dans l’eau pour la révélation des nucléosides et des oligonucléotides modifiés et non modifiés et des composés tritylés, une solution de ninhydrine à 1 % dans le butan-1-ol pour la révélation des amines, une solution de 2,6-dichloroquinone-4-chloroimide dans l’éthanol pour la révélation des composés soufrés (colorations différentes pour les fonctions thiophosphate, thiol et disulfure). L’éluant utilisé pour l’analyse des séquences oligonucléotidiques est un mélange isopropanol/ammoniaque/eau (les proportions varient suivant la longueur et la séquence de l’oligonucléotide). Les cuves sont saturées d’éluant 24 heures avant l’analyse. Les plaques CCM sont préalablement éluées dans un mélange DCM/méthanol 9/1 pour faire migrer des impuretés moins retenues.

A. 3. Caractérisation des produits

A. 3. 1. Quantification des oligonucléotides

Les quantités d’oligonucléotides sont données en unités de DO (densité optique) mesurées à la longueur d’onde de 260 nm. Une unité de DO est la quantité d’oligonucléotide qui donne une absorbance de 1 quand elle est dissoute dans 1 mL de tampon et mesurée dans une cuve de trajet optique 1 cm. Cette unité découle de la loi de Beer-Lambert : A = H .l.C où A est l’absorbance (DO), l le trajet optique de la cuve (cm), C la concentration de la solution analysée (mol.L^-1) et H le coefficient d’extinction molaire du composé en solution à une longueur d’onde précise (L.mol ^-1.cm^-1).

Les coefficients d’extinction molaire H260 ouHvis des conjugués sont déterminés par titration (§ B. 5.

1.) dans le cas d’oligonucléotides conjugués, ou par application de la méthode dite « des proches voisins »²⁷⁵ dans le cas de séquences non modifiées. Les coefficients d’extinction molaire Hvis des fluorophores sont déterminés à partir de la valeur d’absorbance de solutions de concentrations connues.

A. 3. 2. Spectrométrie par RMN et masse

Les spectres RMN ¹H, ¹³C, ³¹P sont enregistrés sur un spectromètre Varian Unity 500 (500 MHz) aux fréquences respectives de 500,13; 125,76; 202,46 MHz avec lock deutérium interne. Les échantillons destinés aux études RMN sont mis en solution dans des solvants deutérés (précisé au niveau des données RMN de chaque produit) en utilisant respectivement comme référence interne le tétraméthylsilane (TMS) pour les spectres ¹H et ¹³C et l’acide phosphorique 85 % externe pour les spectres ³¹P. Les constantes de couplages (ⁿJ) sont exprimées en Hertz (Hz), les déplacements chimiques (G) sont exprimés en ppm. Lorsque les spectres sont du premier ordre ou peuvent être analysés comme s’ils l’étaient, les signaux sont désignés par les lettres: s (singulet), d (doublet), t (triplet), q (quadruplet), dd (doublet dédoublé). Dans le cas contraire, la lettre m (multiplet) est indiquée.

Les spectres de masse sont obtenus par Electrospray (ESI/ MS/ MS) sur un appareil VG Quattro II (Microsmas) ou par MALDI sur un appareil Autoflex de chez Bruker (Maldi-TOF). Les échantillons d’oligonucléotides (0,1 DO environ) sont fournis lyophilisés.

A. 3. 3. Spectroscopies d’absorption et de fluorescence

Les spectres d’absorption sont enregistrés sur un spectrophotomètre Kontron Uvikon 860 à double faisceau dans des cuves de 1 mL avec un trajet optique de 1 cm (Hellma). Les mesures à basse température sont réalisées en soumettant la cuve à un courant d’azote afin de réduire les phénomènes de condensation sur les parois. Les cuves sont thermostatées à l’aide d’un cryostat Bioblock.

Les spectres d’excitation et d’émission de fluorescence sont enregistrés sur un spectrofluorimètre Fluoromax 2 (ISA-Jobin-Yvon) dans des cuves de 600 µL en quartz Suprasil, de trajet optique de 5 mm (Hellma) avec une largeur de fente de 2 nm et une mesure tous les 0,5 nm. Les mesures sont réalisées avec des solutions d’oligonucléotides 1 µM dans un tampon choisi en fonction de l’étude.

Les spectres sont corrigés suivant les différents rendements de la lampe aux longueurs d’ondes utilisées pour l’étude. Sauf mentions contraires, les spectres d’émission sont enregistrés après excitation au Omax du spectre d’absorption, tandis que les spectres d’excitation sont enregistrés au Omax

du spectre d’émission. L’intensité de fluorescence est proportionnelle à la densité optique (DO) pour des absorbances inférieures à 0,1.

A. 4. Systèmes chromatographiques de purification

Avant toute purification, les échantillons sont filtrés à l’aide de filtres adaptables sur seringue, GHP Acrodisc^” 13 mm, membrane GHP 0,2 µm. Les analyses et purifications d’oligonucléotides sont généralement effectuées sur un appareil CLHP 600 E Waters équipé d’un détecteur à barrette de diodes Waters 996. les analyses et purifications sont réalisées par chromatographie en phase inverse sur une colonne Lichrospher^” 100 RP-18 (5 µm, 125 mm u 4 mm) Merck. Un gradient linéaire d’acétonitrile (5 à 50 % sur 60 min) dans un tampon AA 0,1 M, pH 7 est utilisé à un débit de 1 mL/min.

L’élution est suivie à 260 nm et au maximum d’absorption du marqueur fluorescent le cas échéant.

Après élimination de l’acétonitrile, les solutions d’oligonucléotides sont lyophilisés 3 fois avant couplage ou analyse par spectrométrie de masse.

Les analyses et purifications des oligonucléotides riches en purines ainsi que les séquences modifiées en 3’ sont effectuées par chromatographie d’échange d’ions à l’aide d’un appareil Pharmacia en utilisant une colonne Mono Q (8 µm, 10 u 100 mm, Pharmacia) et en employant un gradient linéaire de NaCl 1,5 M (0,5 %/min) dans un tampon TRIS 25 mM, pH 8 contenant 10 % de méthanol (0,5 %/min). L’élution est suivie à 260 nm. Le dessalage des solutions d’oligonucléotides récupérées après purification par échange d’ions est réalisé à l’eau en phase inverse sur une colonne Lichroprep^” RP-18, 40-63 µm (10 u 100 mm). Les oligonucléotides sont élués avec un gradient de méthanol dans l’eau et un débit de 4 mL/min.

Les purifications sur colonne d’exclusion stérique sont réalisées sur des colonnes G-10 ou G-25 Sephadex^TM en utilisant de l’eau distillée comme éluant.

Les purifications chromatographiques sur colonne de silice sont réalisées en utilisant le gel de silice 60 Merck 9385 de granulométrie : 40-63 µm.

Pour certains composés, une étape de purification supplémentaire est réalisée sur des plaques de silice préparatives, (Macherey-Nagel SIL 6-200 UV254) ou Merck 5717, 2 mm d’épaisseur, format 20 × 20 cm.

A. 5 Stockage des produits

Les produits solides sont séchés sous vide dans un dessicateur contenant de l’anhydride phosphorique (P2O5) ou de la potasse (KOH) à l’abri de la lumière puis stockés au congélateur. Les oligonucléotides sont conservés lyophilisés.

A. 6. Synthétiseur d’oligonucléotides

L’assemblage des séquences oligonucléotidiques est réalisé sur un synthétiseur Expedite 8909 de Perspective Biosystems à l’échelle de 1 µM en utilisant les phosphoramidites et supports commerciaux ainsi que les réactifs et supports décrits précédemment (Chapitre résultats).

A. 7. Oligonucléotides commerciaux