Les méthodes de synthèse des sondes oligonucléotidiques fluorescentes

le choix de la position du marqueur s’effectue en fonction des propriétés re herchées.

I. 1. Incorporation directe du marqueur à l’oligonucléotide lié au support au cours de l’assemblage e

II

L’incorporation du ligand peut s’effectuer suivant deux stratégies: lors de l’assemblage de l’oligonucléotide avant l’étape de déprotection via l’incorporation de leurs dérivés phosphoramidite ou H-phosphonate ou de supports modifiés ou après déprotection de l’oligonucléotide par réaction en solution sur une ou plusieurs fonctions adéquates incorporées aux sites choisis pour la liaison des marqueurs. Les propriétés des oligonucléotides fonctionnalisés dépendent beaucoup des paramètres de liaison qui doivent permettre une interaction optimale du ligand avec le complexe formé après hybridation. Leur spécificité d’hybridation ne doit pas être diminuée par la présence du ou des marqueurs. De nombreuses positions sont accessibles sur l’oligonucléotide : aux extrémités 3’ ou 5’

de la séquence, en position interne sur le sucre, au niveau des fonctions phosphate internucléotidiques, sur les bases hétérocycliques. Une fonctionnalisation aux extrémités est avantageuse dans le cas où une perturbation minimale de la structure est désirée. Une position plus interne à la séquence est plus favorable à l’interaction du ligand avec le complexe formé. D’une manière générale,

c II

ositions 2, 6, 7 et 8 des purines et en p

l’assemblage, il est possible

’employer des supports modifiés^{95, 99} dont certains sont commerciaux.

Cette méthode n’est utilisable que si le marqueur résiste aux conditions d’assemblage et de déprotection de l’oligonucléotide. La molécule à coupler doit également être soluble dans le solvant de réaction (acétonitrile le plus souvent) et être disponible en quantité relativement importante. De plus, sa présence ne doit pas gêner le couplage suivant. Plusieurs méthodes d’incorporation directe⁹⁵ en diverses positions prédéfinies ont été développées et passent par l’utilisation de supports modifiés comportant le ligand, de dérivés phosphoramidite ou H-phosphonate du ligand, d’un nucléoside modifié comportant le ligand ou d’analogues de nucléosides naturels. De nombreuses positions des nucléotides ont été utilisées (sur les bases nucléiques en p

ositions 4 et 5 des pyrimidines, sur la position 2’ du sucre).

Des hydrocarbures aromatiques polycycliques ont été introduits par l’intermédiaire de dérivés phosphoramidite ou H-phosphonate préalablement substitués en position anomérique d’un 2’-désoxyribose (pyrène, phénantrène, naphtalène)⁹⁶, (pérylène)⁹⁷. Le pyrène a également été fixé sur plusieurs bases nucléiques naturelles⁹⁸ et également par l’insertion d’un lien non naturel à la place d’un nucléoside⁹¹. Afin d’incorporer des ligands (acridine, psoralène, pyrène, anthraquinone, fluorescéine, …) à l’extrémité 3’ de l’oligonucléotide au cours de

d

Plusieurs équipes ont développé des réactifs afin d’introduire le ligand directement sur colonne après élongation de la séquence sur support. Il est possible d’obtenir des séquences possédant des marqueurs différents à partir d’une seule synthèse d’oligonucléotide. Un couplage alcyne-alcyne catalysé au cuivre permet de coupler un marqueur (fluorescéine, anthraquinone, biotine) à une base modifiée introduite au cours de la synthèse¹⁰⁰. Il est également possible d’utiliser des bases modifiées comportant des groupes photolabiles afin d’incorporer à l’oligonucléotide sur support des fonctions réactives amine ou acide carboxylique¹⁰¹ permettant le couplage du ligand correspondant après irradiation à la fin de l’élongation.

I + _RSH S-R

NaSCSNEt₂ SH

NH₂ NaN₃

Schéma 6 : Réactivité des 5’-iodo-oligonucléotides sur support avant déprotection.

Des conjugués comportant le naphtalène ont été obtenus à partir des 5’-iodo-oligonucléotides¹⁰² (Schéma 6).

III. 2. Couplage du ligand sur l’oligonucléotide déprotégé103, 104, 105, 106

(Figure 12 et schéma 7)

De nombreux ligands ne peuvent pas supporter toutes les conditions réactionnelles des méthodes de synthèse oligonucléotidique et notamment les conditions de déprotection. C’est pourquoi l’introduction post-synthétique de ligands est particulièrement intéressante pour obtenir les conjugués visés. De plus, de nombreux ligands ne sont pas assez solubles ou ne sont disponibles qu’en petites quantités et la préparation des analogues de nucléosides pour la synthèse automatisée peut prendre beaucoup de temps. Dans la grande majorité des cas, un bras de liaison est utilisé pour greffer le ligand car les oligonucléotides non modifiés ne présentent pas de fonctions susceptibles de réagir sélectivement et efficacement. De plus, le bras de liaison a une influence importante sur les propriétés de l’oligonucléotide conjugué. Ce bras peut être fixé au marqueur ou à l’oligonucléotide. Il peut également se composer de deux parties, une sur l’oligonucléotide et l’autre sur le marqueur.

La fonction réactive peut être introduite au cours ou à la fin de l’assemblage à l’aide le plus souvent de dérivés phosphoramidite ou H-phosphonate et des supports modifiés préalablement synthétisés ou commerciaux. C’est pourquoi de nombreux supports modifiés ont été développés qui permettent d’obtenir après déprotection un oligonucléotide dont l’hydroxyle à l’extrémité 3’ est fonctionnalisé. De nombreuses fonctions réactives peuvent être obtenues par l’intermédiaire d’un support modifié^{95, 99,}

107. La réaction de couplage du marqueur s’effectuera sur l’oligonucléotide purifié en milieu aqueux ou en milieu organique en présence d’éthers couronne pour solubiliser l’oligonucléotide⁵⁶.

D’une façon générale, les positions fonctionnalisables sont : les extrémités 5’ et 3’, le phosphate internucléotidique, le sucre en 1’ et 2’, les bases nucléiques (aux positions 4 et 5 des pyrimidines ; 2 et 7 des guanines ; 2, 6 et 7 des adénines) (Flèches rouges, figure 12). La fonctionnalisation aux positions 2 des guanines, 6 des adénines et 4 des pyrimidines peut gêner la formation des liaisons hydrogène lors de l’hybridation avec des brins d’acides nucléiques (Flèches bleues, figure12).

O

Figure 12 : Positions d’insertion de fonctions réactives sur les oligonucléotides dans le but d’un couplage après déprotection.

Des fonctions amine peuvent coupler avec des ligands comportant des groupements isothiocyanate, ester activé, (anhydride mixte), aldéhyde en présence d’un agent réducteur (ex : NaBH3CN). Il est également possible de les modifier à l’aide de réactifs tel que le CDI¹⁰⁸ pour ensuite les coupler à d’autres fonctions amine.

Des fonctions thiophosphate et thiol peuvent réagir avec des ligands comportant des groupements halogénure d’alkyle, disulfure, iodoacétamide, halogénoacétyle, maléimide. La fonction thiol est plus réactive que la fonction thiophosphate, cette dernière étant plus réactive lorsqu’elle se situe aux extrémités plutôt qu’en position internucléotidique. Dans ce dernier cas, un mélange de deux diastéréoisomères est obtenu.

Une fonction azide peut coupler avec des ligands comportant des groupements alcyne vrai (click chemistry). Une fonction aminooxy peut coupler avec des ligands comportant des groupements aldéhyde. Une fonction acide carboxylique peut réagir à l’aide d’un réactif de couplage avec des fonctions amine. Les groupements phosphate terminaux peuvent réagir à l’aide d’un réactif de couplage avec des ligands comportant des fonctions amine.

C(O)-NH-R

III. 3. Polymarquage

Il est possible d’effectuer différents types de polymarquage de l’oligonucléotide¹⁰⁹. Plusieurs dérivés phosphoramidite ou H-phosphonate comportant des ligands identiques ou différents peuvent être incorporés au cours de la synthèse. Plusieurs ligands identiques peuvent être couplés sur plusieurs fonctions réactives identiques après déprotection. Il est également possible de coupler des ligands différents sur des fonctions réactives correspondantes introduites au cours de la synthèse. Des combinaisons de méthodes d’incorporation directe et après déprotection sont également envisageables. D’une manière générale, la mise au point des polymarquages n’est pas évidente. Il faut choisir judicieusement les positions d’ancrage des ligands, leur présence ne doit pas faire chuter les rendements de couplage. De plus, la purification d’oligonucléotides polymarqués s’avère compliquée. Il a été décrit que la fluorescence de certains marqueurs peut être inhibée lorsqu’ils se trouvent à proximité les uns des autres, d’autant plus si ces marqueurs sont hydrophobes (le rendement quantique d’un oligonucléotide polymarqué avec la cyanine commerciale Cy3 est maximal lorsqu’elle est incorporée toutes les 6 paires de bases¹¹⁰).

IV. Les principaux formats d’hybridation