Matériel et méthodes

Les étapes décrites ici correspondent aux protocoles différents de ceux évoqués dans l’article pour l’exemple de l’anticorps anti N-VEGF. Toutes les autres étapes (identification des sites cryptiques, analyse RT-PCR, culture cellulaire, transfection, Western-Blot) sont réalisées de la même façon et ne seront pas évoquées à nouveau. Les noms des différentes amorces utilisées seront précisés dans la légende des figures correspondantes et leurs séquences sont données en annexe 1.

- Clonage des chaînes de l’anticorps dans le vecteur bicistronique à épissage :

La première étape a donc été la re-construction des séquences codant pour chacune des chaînes de cet anticorps, avant de les cloner dans le vecteur bicistronique à épissage. Pour cela, les parties variables de chaque chaîne ont été reconstituées par hybridation d’oligonucléotides chevauchants, en se basant sur la séquence obtenue dans le brevet mentionné ci avant. Pour chacune des chaînes, 8 oligonucléotides ont été dessinés de longueurs variables entre 70 et 82 mers (4 sens et 4 antisens) qui présentent des séquences chevauchantes de 20 à 25 nucléotides. Les séquences ont été dessinées de façon à :

1) ajouter un site de restriction à l’extrémité 5’ pour permettre le clonage dans le vecteur bicistronique (BamHI pour la chaîne légère et PacI pour la chaîne lourde)

2) ajouter l’hexanucléotide GCCACC entre ce site et le codon ATG (séquence Kozak pour faciliter la reconnaissance du codon d’initiation de la traduction)

3) ajouter à l’extrémité 3’du fragment 30 nucléotides correspondant au début de la chaîne constante pour réaliser ensuite une PCR chevauchante avec la partie constante des chaînes amplifiée à partir du vecteur codant pour l’anti N-VEGF (anticorps murin lui aussi).

Un dernier paramètre a enfin été considéré. Afin de faciliter l’étape suivante d’analyse et de suppression des sites cryptiques d’épissage, le dessin des oligonucléotides a également été fait de façon à supprimer au maximum de la séquence les dinucléotides GT (sites donneurs potentiels) et AG (sites accepteurs potentiels).

Ceci a été fait de façon à ne pas modifier la séquence en acides aminés des chaînes en modifiant soit, une des deux bases des motifs GT ou AG, soit, quand cela n’était pas possible sans affecter la séquence protéique, en mutant une base adjacente au dinucléotide de façon à s’écarter le plus possible de la séquence consensus. Cette approche n’a été possible que dans la mesure où les chaînes étaient reconstituées de novo et non clonées à partir d’une séquence existante.

Les séquences des oligonucléotides ainsi dessinés, ainsi que les autres amorces évoquées dans cette section, sont indiquées en annexe 1 (Av-l-F1 à 4 et Av-l-R1 à R4 pour la chaîne légère ; Av-L-F1 à 4 et Av-L-R1 à 4 pour la chaîne lourde).

Le protocole utilisé pour l’hybridation des oligonucléotides est adapté de la publication de Xiong et al., 2004. Pour chacune des parties variables, les huit oligonucléotides correspondants sont mélangés dans les quantités suivantes : 30 pmoles de chaque oligonucléotide externe (Av-l-F1 et –R4 pour la chaîne légère ; Av-L-F1 et -R4 pour la chaîne lourde) et 1,5 pmoles de chacun des 6 oligonucléotides internes. Le tout est ensuite soumis à une amplification PCR en utilisant le mélange iProof High-Fidelity Master Mix (Biorad) selon les instructions du fabricant (25 cycles, Tm = 60°Cet 15 secondes d’élongation). Les produits PCR ainsi générés sont déposés sur gel d’agarose 2%, les bandes correspondantes sont découpées et purifiées à l’aide du kit Nucleospin Extract (Macherey Nagel).

Les parties constantes sont amplifiées par PCR à partir du plasmide pA1 (contenant les chaînes codant pour l’anti N-VEGF décrit dans l’article) avec les amorces cste-KAv-F et –R pour la chaîne légère et cste-LAv-F et –R pour la chaîne lourde. Les amorces antisens contiennent respectivement les sites XbaI et EcoRV qui permettront l’insertion du fragment dans le vecteur bicistronique. Les fragments sont purifiés dans les mêmes conditions et utilisés ensuite dans une réaction PCR avec les fragments correspondant aux parties variables avec les amorces suivantes : KAv-ent-F et cste-KAv-R pour la chaîne légère et LAv-ent-F et cste-LAv-R. Les fragments ainsi générés sont sous-clonés dans un vecteur navette (pCR4- TOPO, Invitrogen) et leur séquence vérifiée.

La chaîne légère est ensuite clonée dans le vecteur pA1 via les sites de restriction BamHI et XbaI (premier cistron). Le plasmide résultant est ensuite digéré avec les enzymes PacI/HindIII et HindIII/EcoRV pour enlever la séquence codante pour la chaîne lourde de l’anti N-VEGF et la remplacer par la chaîne lourde de l’anti VEGF via les sites de restriction PacI et EcoRV (second cistron). Le plasmide ainsi généré, contenant les chaînes codant pour

- Quantification des anticorps sécrétés dans les surnageants de culture :

Un anticorps anti-IgG de souris spécifique de la chaîne gamma (SIGMA, M1397) dilué à 5ug/mL dans du PBS (100µl/puits) est adsorbé, dans un premier temps, sur les microplaques. L’incubation se déroule à 4°C pendant la nuit. Le lendemain, les plaques sont lavées trois fois avec la solution de lavage (PBS/Tween 0,1%). La solution de blocage (PBS/lait 2%) est ensuite incubée pendant deux heures à température ambiante (200µl/puits). Après trois nouveaux lavages, différentes dilutions des surnageants de culture réalisées dans la solution de lavage sont incubées pendant 2 heures à température ambiante (100µl/puits). Après 4 lavages, un anticorps anti-IgG de souris spécifique du fragment Fab (SIGMA, A2304) est dilué au 1/5000ème dans la solution de lavage et incubé deux heures à température ambiante (100ul/puits). Six lavages sont suivis du dépôt de 100µl de substrat TMB (BD OptEIA), la réaction est incubée à l’abri de la lumière maximum 30 minutes et stoppée par l’addition de 50µl de H2SO4 2N. La DO450 est ensuite mesurée à l’aide d’un lecteur de plaque

(UVM340, Asys).