Marquage de la fasciculine
La Fas2 (Latoxan) est marquée de manière covalente sur les NH2 libres en utilisant des dérivés NHS-XX. Dans les protéines matures, les résidus NH2 libres sont présents sur les chaînes latérales des résidus de lysine et sur l’extrémité N-terminale de la chaîne carbonée. Puisque certaines des lysines de la Fas2 participent à l’interaction avec l’AChE, les conditions de marquage doivent limiter la modification de ces résidus pour efficacement dériver
Toxines et fonctions cholinergiques neuronales et non neuronales 99 le NH2 de l’extrémité N-terminale. Cette spécificité est
obtenue en réalisant la réaction à pH 7,2, en se basant sur la différence des valeurs de pKa des résidus lysine et du N-terminal.
D’un point de vue pratique, la Fas2 est solubilisée dans un tampon Hepes 20 mM à pH 7,2 à une concentration supérieure à 1,5 mg/mL. Le dérivé actif NHS-XX-biotin (Sigma), NHS-XX-Alexa (Molecular Probe) est ajouté dans un rapport molaire marqueur/Fas2 de 2:1. Après 1h30 d’incubation sous agitation et à température ambiante, la toxine est séparée des molécules non incorporées à l’aide d’une colonne NAP5 (Amersham Biosciences).
Le sérum polyclonal de lapin anti-AChE a été obtenu par Marsh (Marsh et al., 1984).
Animaux
Les souris sont des hybrides F1 B6D2, animaux élevés avec un cycle jour nuit 12h-12h et avec nourriture et boisson à volonté.
Préparation du matériel histologique ; trois types d’approches pour marquer l’AChE
Préparation des tissus pour les marquages ex vivo
La souris est anesthésiée, et est perfusée par voie transcardiaque avec du sérum physiologique (NaCl 0,9%) puis un fixateur [paraformaldéhyde (PFA) 2%], auquel est ajouté du glutaraldéhyde (0,2%) lorsque des expériences de microscopie électronique sont envisagées.
Le cerveau et les muscles sont prélevés, incubés une nuit dans le PFA 2% seul, puis stockés dans du PBS supplémenté en azide de sodium 0,03% jusqu’à utilisation. Les muscles sont disséqués en faisceaux de fibres et le cerveau est débité en coupes de 70 μm d’épaisseur à l’aide d’un vibratome.
L’AChE est détectée sur ces coupes flottantes de cerveau et sur les fibres musculaires, par différentes techniques.
Marquage général par la fasciculine in vivo
La Fas2 (350 μg/kg) est injectée par voie intraveineuse.
Dans ce cas, la Fas2 passe dans la circulation générale et se fixe notamment au niveau de toutes les JNM de l’organisme. Après un délai de 2h, les animaux sont préparés comme précédemment. La Fas2 ne traversant pas la barrière hémato-encéphalique, l’AChE du cerveau ne peut pas être détectée par cette technique.
Marquage d’un muscle spécifique et saturation des sites Les analyses sont faites sur le sternomastoïdien, un muscle du cou facilement accessible. Après anesthésie, la souris est placée en décubitus dorsal sur la platine d’un microscope adapté. Après incision de la peau du cou, le muscle est disséqué et une cuvette est confectionnée à l’aide de la peau et des tissus voisins. Cette cuvette permet l’incubation de solutions, dont la Fas2 marquée ou non, au contact des JNM situées au milieu des fibres musculaires (Akaaboune et al., 1999). La JNM marquée peut être visualisée à l’aide d’un microscope droit équipé d’un système d’analyse d’images. La dynamique de l’AChE peut être suivie pendant plusieurs jours. Dans ce cas, l’incision est suturée après chaque observation et le rétablissement de la souris est attendu avant toute nouvelle session de travail.
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Utilisation de la fasciculine 2, une toxine de venin de serpent, pour étudier l’acétylcholinestérase in vivo 100
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Toxines et fonctions cholinergiques neuronales et non neuronales 101 Rencontres en toxinologie, 2008
Editions de la SFET
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