2.1 Préparation des groupes expérimentaux pour le traçage anatomique 2.1.1 Animaux
Nous avons utilisé 26 souris C57BL/6J de génotype VGluT2-IRES-Cre (RRID: IMSR_JAX:016963; The Jackson Laboratory) (Vong et al. 2011) mâles pour notre expérience de traçage rétrograde. Ce groupe a par la suite été divisé en deux sous-groupes de 16 souris lésées spinalement (« SCI ») et 10 souris ayant subit une laminectomie sans lésion (contrôles « Sham »; l’abréviation « Sham » sera utilisée dorénavant en référence à ce groupe). Toutes les souris utilisées étaient âgées de 3 à 4 mois (90-121 jours) au début des manipulations. Avant le début des expériences, les souris ont été hébergées en groupe de 3-4 maximum par cage. Après lésion médullaire (Groupes « SCI ») ou laminectomie (Groupes « Sham »), celles-ci ont été isolées à 1 par cage ou groupées par 2 maximum afin de favoriser leur rétablissement post-chirurgical. Les chirurgies (lésions et injections), les expériences comportementales (enregistrements cinématiques de la marche) et les perfusions ont été effectuées conformément aux lignes directrices du Conseil Canadien de Protection des Animaux (CCPA) et approuvées par le comité local de l’Université Laval (CPAC-CHUL).
2.1.2 Enregistrements cinématiques et lésions médullaires
Avant chirurgie, les souris des groupes contrôle « Sham » et médullaire « SCI » ont été entraînées à marcher sur un tapis roulant (LE 8700 series, Panlab) sur une large gamme de vitesses à partir de 5 cm/s et pouvant aller jusqu’à 65 cm/s selon la souris (progression par incréments de 10 cm/s). Afin de témoigner de la capacité des souris à marcher ou courir avant les procédures chirurgicales, nous avons alors enregistré leur locomotion individuelle à chacune de ces vitesses à l’aide de caméras à haute-fréquence (Genie HM640, Dalsa Teledyne : 250 frames/s). Préalablement à ces enregistrements, des marqueurs de peinture réfléchissante ont été peints aux différents points d’articulations des deux pattes postérieures (Crête iliaque, hanche, genou, cheville et métatarse) de chacun des animaux en vue d’une analyse cinématique subséquente. Afin d’installer ces marqueurs, les souris étaient anesthésiées à l’isoflurane (1,5-2% O2) et les enregistrements étaient effectuées
suivant leur réveil complet. Les vidéos ont pu être visionnées par ordinateur à l’aide du logiciel StreamPix 6.0 (Norpix).
Après ces enregistrements, nous avons respectivement constitué nos deux sous- groupes de 10 contrôles « Sham » et 16 lésées (« SCI ») parmi les 26 souris. Avant toute procédure chirurgicale, chaque animal recevait des injections sous-cutanées de 0,2 mL de saline pour leur hydratation et 0,02 mL de l’analgésique buprénorphine hydrochloride SR (SR : 5 mg/kg) pour une analgésie durable post-chirurgie. Sous anesthésie par isoflurane (1,5-2% O2) la souris a été installée dans un appareil stéréotaxique permettant de maintenir
la tête et la queue à chaque extrémité du corps afin de stabiliser la colonne vertébrale. Des injections sous-cutanées d’anesthésiant local lidocaïne-buvicaïne (7,5 mg/kg) étaient aussi effectuées au préalable soit 0,1 mL au dos ; 0,1 mL à la tête et 0,05 mL derrière chaque oreille en raison de la pression exercée par les barres de maintien du stéréotaxe. En ciblant le segment thoracique T10 du côté gauche de la moelle épinière, nous avons tout d’abord incisé la peau du dos puis dégagé les muscles dorsaux entourant les vertèbres à ce niveau. À l’aide d’un rongeur, une laminectomie a alors été effectuée, c’est-à-dire que la partie supérieure de la vertèbre cible a été cassée puis retirée à l’aide d’une pince fine. Pour les souris « SCI », un micro-ciseaux a été utilisé afin d’effectuer une transsection latérale de la moelle épinière gauche au niveau thoracique 10 (T10). Les souris contrôles « Sham » ont subi la même procédure que les souris lésées « SCI » mais sans subir de transsection de la moelle épinière.
Une semaine après chirurgie, nous avons enregistré la marche des souris « Sham » et « SCI » sur tapis roulant une fois par semaine pendant une durée de 7 semaines selon la même méthode d’enregistrements cinématique présentée plus tôt. En raison des lésions toutefois, la gamme de vitesse a été grandement réduite (5 cm/s à 35 cm/s; incréments de 5) en particulier pendant les 3 premières semaines post-lésion. Ces enregistrements ont pour objectif de nous permettre d’observer le degré de récupération fonctionnelle des souris médullaires « SCI » au fil du temps à partir de la première semaine suivant la lésion jusqu’à la septième semaine. Un suivi serré a été fait sur toutes les souris de ces expériences et les
vessies des souris lésées ont été vidées deux fois par jour jusqu’à récupération de leur capacité à uriner.
2.2 Traçage cellulaire rétrograde avec Fast-Blue
8 semaines après la lésion (les enregistrements ayant été réalisés 1 fois par semaine pendant 7 semaines après la lésion), nous avons injecté un traceur rétrograde, en l’occurrence le Fast-Blue, dans la partie droite du noyau gigantocellulaire de la MRF (GRN) des 10 souris contrôles « Sham » et des 16 souris médullaires « SCI » (Figure 14
A). Sous anesthésie par isoflurane (1,5-2% O2), les souris ont à nouveau été placées dans un
appareil stéréotaxique. Avant chirurgie, selon une procédure similaire à celle présentée pour les lésions et laminectomies chaque animal recevait des injections sous-cutanées de 0,2 mL de saline pour leur hydratation et 0,02 ml de l’analgésique buprénorphine hydrochloride SR (SR : 5 mg/kg). 0,1 mL de lidocaïne-buvicaïne (7,5 mg/kg) a été injecté en sous-cutané sur le dessus de la tête et 0,05 mL de plus derrière chaque oreille pour les mêmes raisons que mentionnées plus tôt. Après s’être assuré du bon maintien de la tête dans le stéréotaxe, nous avons effectué une craniotomie aux coordonnées antéropostérieurs et latérales correspondant au GRN côté droit (GRN, coordonnées par rapport au Bregma; Antéropostérieur (AP): 5,5 mm; Médiolatéral (ML): 0,5 mm). Pour l’injection, nous avons utilisé une neuro-seringue Hamilton 2 µL que nous avons descendu lentement (GRN, Profondeur (D) : 5,5 mm) pour injecter 50 nL de Fast-Blue (2% suspension dans 0.1M PBS (phosphate buffer avec 2% diméthylsulphoxide)), EMS-Chemie). Afin de limiter le risque de fuite du traceur, la neuro-seringue était maintenue en place pendant 2 minutes puis retirée lentement.
2.3 Perfusions, sélections des souris analysables et immunohistochimie
Les souris (« Sham » et « SCI ») ont été par la suite sacrifiées après un minimum de 3 jours d’attente permettant le transport du Fast-Blue dans le tronc cérébral et le mésencéphale. Les animaux ont été profondément anesthésiés avant d’être sacrifiés par perfusion transcardiaque avec injection de 10 mL de saline (0,9% NaCl) suivit de 20 mL de paraformaldéhyde (4% PFA à 0,1 M PBS). Nous avons alors prélevé le cerveau et la moelle épinière de chaque souris puis les avons post-fixés avec du PFA 4% avant de les transférer
dans du sucrose 30% (0,1 M PBS) jusqu’à saturation. Les tissus ont alors été congelés dans un médium de congélation Leica puis coupés coronalement au cryostat (Leica, CM 1860, Allemagne) en section de 20 µm d’épaisseur.
En vue de nos analyses anatomiques, nous avons sélectionnées les souris qui correspondaient à nos critères d’admissibilité. Ces derniers étant la qualité de l’injection de Fast-Blue dans le GRN pour les « Sham » et « SCI » ainsi que la validité de la lésion chez les souris médullaires « SCI » exclusivement. Les images présentées ont été prises avec un microscope Axio Imager M2 connecté à une caméra AxioCam utilisant le logiciel de microscopie ZEN2 (Zeiss, Allemagne). Seules les souris présentant une injection de Fast- Blue restreinte à la partie droite de la MRF ont été sélectionnées (Figure 14 B) dans un premier temps (5 contrôles « Sham » et 10 souris médullaires « SCI »). Dans un second temps, nous avons validé la qualité de l’hémi-lésion thoracique des souris « SCI ». Ce critère s’évaluant en 3 points : La lésion est-elle bien à gauche? Est-elle bien au niveau thoracique? Est-ce bien une lésion partielle et est-elle suffisante sans pour autant être excessive (40-50% de matière blanche lésée)? Les deux premiers points ont été vérifiés qualitativement en observant les sections de moelles épinières et le dernier point a été vérifié qualitativement et quantitativement. Afin de déterminer quantitativement l’importance des hémi-lésions, nous avons calculé la surface de matière blanche lésée du côté gauche en comparant les sections lésées avec des sections intactes individuellement pour chaque souris à l’aide du logiciel Image J (voir Figure 15). Les lésions correspondantes, en moyenne et par souris, à une destruction de 40% à 50% de la matière blanche du côté gauche ont été retenues. 11 souris « SCI » sur 16 remplissaient ces critères. Ainsi, nous avons finalement sélectionné 5 souris contrôles « Sham » et 5 souris médullaires « SCI » valides, c’est-à-dire présentant à la fois une injection de Fast-Blue de qualité (pour les deux groupes) et une lésion appropriée (pour le groupe lésé).
Nous avons par la suite sélectionné chez les souris « SCI » les sections de cerveaux coupés au cryostat qui correspondaient à la MLR d’après le Brain Mouse Allen Atlas (http://mouse.brain-map.org/) et le Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates Atlas (Paxinos et Franklin, 2004 (2ème Éd.); Paxinos et Franklin, 2008 (3ème Éd.)). Sur ces sections, nous
avons alors effectué une immunohistochimie Cre et ChAT. Les anticorps primaires utilisés sont donc l’anti-choline acétyltransférase (ChAT) de dilution 1:100 (Chemicon-Millipore, AB144P) et l’anti-Cre recombinase (Cre) de dilution 1:1000 (EMD Millipore, MAB 3120). Les anticorps secondaires suivant ont été utilisés : donkey anti-mouse-AF594 de dilution 1:1000 (Thermofisher scientific, A-21203), donkey anti-goat-AF488 de dilution 1:1000 (Abcam, AB150129). Les lames ont ensuite été montées (Mountant, Permafluor; REF : TA-030-FM; Thermoscientific) pour observation au microscope à épifluorescence.
2.4 Observations et analyses stéréologiques des corrélats anatomiques potentiels de la MLR
À l’aide d’un microscope à épifluorescence (Olympus BX51, Tokyo, Japon) associé à un logiciel de stéréologie (Stereo Investigator, MicroBrightField Bioscience, Colchester, VT) nous avons examiné le marquage immunohistochimique et rétrograde des corps cellulaires neuronaux. On peut ainsi observer (Figure 16 B) les neurones glutamatergiques (VGluT2) en rouge, les neurones cholinergiques (ChAT) en vert et les neurones marqués rétrogradement (Fast-Blue) en bleu. La colocalisation entre ces différentes couleurs peut indiquer un neurone qui est à la fois glutamatergique et cholinergique (rouge et vert) que nous avons choisi d’appeler neurone « double », un neurone glutamatergique rétrograde (rouge et bleu), un neurone cholinergique rétrograde (vert et bleu) ou encore un neurone « double » rétrograde (rouge, vert et bleu).
À l’aide du Brain Mouse Allen Atlas (http://mouse.brain-map.org/) et du Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates Atlas (Paxinos et Franklin, 2004 (2ème Éd.); Paxinos et Franklin, 2008 (3ème Éd.)) ainsi que de l’immunomarquage (Exemple avec le marquage ChAT mettant en évidence la population cholinergique du PPN, Figure 16 A), nous avons identifié et délimité les contours de chaque corrélat anatomique supposé de la MLR. Par la suite, nous avons quantifié grâce à Stereo Investigator les neurones en fonction de leur(s) neurotransmetteur(s) à l’intérieur de chacun de ces noyaux par sous-échantillonnage aléatoire. Les zones de comptage étaient constituées de carrés de 50 à 150 µm2 selon les noyaux (la taille des fenêtres étant déterminée en fonction des régions d’intérêt et de la taille des noyaux). On peut ensuite estimer le nombre de neurones en fonction de la surface
des sections et du volume des noyaux. L’estimation est calculable par le logiciel et vérifiable « à la main » grâce à la formule suivante :
Population neuronale estimée = Nombre de cellules comptées / (SSF×ASF×HSF)
Où SSF = Intervalle entre les sections; ASF = Aire de la zone de comptage/aire de la zone d’échantillonnage; HSF = Épaisseur des sections/Hauteur de la zone de comptage stéréologique
Une fois cette quantification effectuée, les fichiers de comptage ont été analysés à l’aide de différents scripts MATLAB personnalisés. En utilisant le plancher ventral du quatrième ventricule et la partie caudale du LDT comme références (coordonnées X=0, Y=0 et Z=0), les coordonnées en X (médiolatéral), Y (profondeur) et Z (antéropostérieur) de chaque neurone ont été enregistrées et combinées en une matrice tridimensionnelle (3D) en fonction de leurs noyaux, de leurs neurotransmetteurs et de leur marquage rétrograde. Des matrices en 2D ont aussi été conçues dans chaque axe afin d’obtenir une représentation 2D de la quantité moyenne de neurones selon chacun d’eux. Finalement, nous avons aussi produit des figures représentant la quantification de neurones marqués par l’immunohistochimie et par le Fast-Blue dans chacun des noyaux toujours selon leurs neurotransmetteurs (Figures 19 à 22). Les barres d’erreur représentent l’écart-type. Les quantités présentées représentent la moyenne de celles des souris selon le groupe auxquels elles appartiennent (contrôle « Sham » ou médullaire « SCI »).
2.5 Analyse cinématique
Pour analyser les enregistrements cinématiques, nous avons dans un premier temps coupé les vidéos dans StreamPix 6.0 afin d’obtenir pour chaque enregistrement une séquence d’un minimum de 12-15 pas de la patte postérieure gauche (patte de référence). Ces séquences ont par la suite été analysées à l’aide d’un logiciel personnalisé en posant des marqueurs digitaux indiquant les phases de contacts et soulèvements de chaque patte. Les marqueurs réfléchissants précédemment mis aux points d’articulation des pattes postérieures permettent au logiciel de déterminer leur position au cours de la locomotion et
d’analyser l’extension angulaire. Le genou étant une articulation bougeant beaucoup sous la peau lors de la marche, sa position a été inférée par triangulation avec les positions de la hanche et de la cheville en utilisant donc la longueur du fémur et du tibia. L’analyse terminale de ces données a été faite à l’aide d’un script logiciel de MATLAB afin de modéliser les figures. Cette analyse vise, comme précédemment mentionné, à nous permettre de comparer la locomotion avant lésion et avec celle des semaines suivant la lésion afin d’évaluer la récupération fonctionnelle de la marche des souris médullaires.
2.6 Analyses statistiques
Les comptes totaux de cellules sont présentés selon le format « estimation moyenne du nombre de neurones ± écart-type » et les vitesses maximales de locomotion sous la forme « vitesse maximale moyenne ± écart-type ». Les astérisques représentent à quel point les différences entre les moyennes sont significativement différentes entre elles (Degré de significativité : *p<0,05; **p<0,005; ***p<0,001, ****p<0,0001). La normalité des données a été vérifiée grâce au test de Shapiro-Wilk et l’homocédasticité des données avec Bartlett afin de choisir entre l’utilisation d’un test paramétrique ou non-paramétrique. Ainsi, afin de comparer les moyennes de neurones de même type entre les noyaux d’un même côté nous avons utilisés l’ANOVA à une voie et le test de Tukey HSD ou le test de Kruskal-Wallis dépendamment de la distribution des données (normalité et homocédasticité). Afin de comparer les moyennes de neurones de même type appartenant à un même noyau mais de côtés différents (ipsilatéral ou contralatéral à la lésion) nous avons utilisé un test de t à deux échantillons ou le test de Mann-Whitney Wilcoxon. Ces mêmes tests (tests de t et de Mann-Whitney) ont été utilisés afin de comparer les moyennes de neurones de même type dans un même noyau (et de même côté) pour les groupes contrôle « Sham » et médullaire « SCI » mais ils n’ont pas été « pairés » étant donné que le groupe « Sham » ne correspond pas réellement au groupe lésé avant lésion comme il est composé d’individus différents. Les vitesses maximales moyennes au fil des semaines (avant lésion et au cours des 7 semaines suivantes) ont été analysées par ANOVA à une voie (suivi du test post-hoc de ukey HSD) ou Kruskal-Wallis selon la distribution des données et des comparaisons entre deux semaines ont été effectuées avec le test de t ou le test de Mann- Whitney Wilcoxon.
Figure 13. Résumé chronologique des manipulations effectuées pour le traçage cellulaire rétrograde
Traçage cellulaire rétrograde
26 souris VGluT2-ires-Cre mâles