Matériel et méthodes

Animaux et modèle tumoral:

Les souris C57BL/6 (B6) et OT-IB6.SJLRag1-/- _{(OT-IB6SJL) ont été élevées au Centre de}

Recherche Hospitalier Maisonneuve-Rosemont. Les souris ont été placées dans un environnement exempt d'agents pathogènes et traitées conformément aux lignes directrices du Conseil Canadien de Protection des Animaux. Notre protocole animal a été approuvé par le Comité de protection des animaux de l'Hôpital Maisonneuve-Rosemont.

La lignée tumorale de carcinome pulmonaire de Lewis (Lewis Lung Carcinoma-LLC) transfectée de façon stable pour exprimer à sa surface le peptide SIINFEKL (OVA) associé au CMH de classe I H2Kb (LLC-OVA). Les LLC-OVA a été mise en culture dans du milieu complet (DMEM, 10%FBS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 50 μg/ml Streptomycin (Invitrogen)) supplémenté de 5mg/ml de G418 (Wisent). Cette lignée tumorale a été choisie car c'est une lignée épithéliale exprimant l'E-Cadherine, le ligand du CD103, essentiel pour vérifier notre hypothèse. 105 _{LLC-OVA ont été injectées en sous-cutané dans le flanc droit de}

souris C57BL/6. Les souris ont été sacrifiées lorsque les tumeurs ont atteint un volume de 1 cm3 _{ou tel qu'indiqué dans l'expérience correspondante.}

Activation des lymphocytes T ex-vivo:

Des lymphocytes T OT-I (LT-OT-I) ont été isolés à partir des rates de souris OT-IB6SJL (CD45.1) et mis en coculture avec des cellules dendritiques (DC) dérivées de la moelle osseuse de souris B6, pulsées avec le peptide OVA (SIINFEKL), à un ratio de 1:10. Les cellules ont été stimulées en présence (+) ou en absence (ø) du TGF-β (5ng/mL; Feldan). La coculture a été réalisée dans des plaques de 24 puits, dans du milieu complet (RPMI1640 10%FBS) supplémenté de 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES, 100 U/ml penicillin et 50 μg/ml Streptomycin et incubée pendant 72 heures à 37°C, à 5% CO2. Les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse ont été obtenues en cultivant des cellules de la moelle osseuse de souris B6 durant 7 jours, en présence de GM-CSF (20ng/mL; Peprotech) et d'IL-4 (20ng/mL) recombinants murins. Un jour avant la fin de la culture, 150 ng/mL de lipopolysaccharide (LPS) (Sigma Aldrich) ont été ajouté à la culture afin de rendre matures les cellules. Les DC ont ensuite été chargées "overnight" avec le peptide ovalbumin (OVA)257-264 (SIINFEKL) (2µg/mL), au dernier jour de la culture. Les DC ont été irradiés à 25Gy avant leur utilisation.

Test de migration cellulaire en Transwell:

Afin de tester la capacité des LT-OT-I traités (+) ou non (ø) au TGF-β à migrer en réponse aux ligands recombinants du CXCR3 ou aux surnageants des tumeurs LLC-OVA, un test compétitif de migration in vitro a été réalisé dans des chambres à filtre de Boyden (Transwell) de 24 puits avec des pores de 3µm de diamètre (Corning). Pour ce faire, du milieu de culture (DMEM+2% FBS) seul (contrôle négatif) ou contenant des concentrations croissantes de chimiokines recombinantes murines (Biolegend), CXCL9, CXCL10 et CXCL11 ou du surnageant de tumeurs LLC a été placé dans le compartiment inférieur du Transwell. Les

surnageants des tumeurs LLC utilisés ont été obtenus après culture de la lignée LLC-OVA dans du milieu de culture (DMEM+2%FBS) pendant 16h. Les surnageants ont par la suite été collectés, centrifugés et placés dans le compartiment inférieur du Transwell. D'autre part, les lymphocytes T (2 x 105_{) récoltés après 3 jours de stimulation en présence (+) ou en absence}

(ø) du TGF-β (tel que décrit ci-dessus) ont été marqués soit avec du 5 - (and 6) - carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) ou du CellTrace Violet (CTV) (Invitrogen), puis mixés à un ratio de 1:1 (2x105_{) avant d'être placés dans le compartiment}

supérieur du Transwell. Après 4 heures d'incubation à 37°C, 5% CO2, les lymphocytes T ayant migré vers la partie inférieure du Transwell ont été énumérés par cytometrie en flux. Afin d'évaluer la migration spécifique aux ligands recombinants du CXCR3, les LT ont été prétraités avec un anticorps neutralisant le CXCR3 (100ng/ml, 2h; CXCR3-173, Biolegend) avant d'être placés dans le compartiment supérieur du Transwell. De même, les LT-OT-I ont été prétraités à la toxine pertussique (PTX) (100ng/ml, 2h; Sigma-Aldrich), un inhibiteur global de la signalisation des récepteurs de chimiokines couplés aux protéines Gαi, dans le but

de déterminer si la migration des LT est dépendante de ces derniers. Les résultats obtenus ont été rapportés soit en nombre absolu de cellules migrantes ou en taux de migration relative calculé par la formule suivante :

Taux de migration relative = (+TGF-β - milieu seul)/(øTGF-β - milieu seul)

Analyses phénotypiques:

Les anticorps suivants ont été utilisés afin de déterminer le phénotype des LT-OT-I traités ou non au TGF-β: CD8 (53-67), CD44 (IM7), CD62L (MEL-14), CCR7 (4B12), CD69 (H1.2F3), CXCR3 (CXCR3-173), CD103 (M290). L'acquisition des données par cytometrie

en flux a été effectuée sur le cytomètre en flux BD LSR2 ou FORTESSAX20 (BD Biosciences). Les données ont ensuite été analysées avec le logiciel DIVA Version 8.7 (BD Biosciences) ou le logiciel Flow Logic (Inivai Technologies).

Tests de migration in vivo:

Pour déterminer si les LT traités au TGF- β ont une meilleure capacité à migrer vers le site de la tumeur, nous avons réalisé un test de migration compétitif in vivo. Pour ce faire, 2x106 _de

LT-OT-I (CD45.1) activés en présence (+) ou en absence (ø) du TGF-β (tel que décrit ci- dessus) ont été marqués soit au CellTrace Violet (CTV) ou au CellTrace Yellow (CTY), puis mixés à un ratio de 1:1, avant d'être injectés par voie intraveineuse à des souris B6 (CD45.2) porteuses d'une tumeur LLC-OVA de 7 jours. Après 3h et 72h du transfert adoptif, les rates et les tumeurs des souris B6 ont été prélevées et apprêtées, puis le ratio de LT-OT-I (CD45.1) fluorescents transférés a été déterminé par cytometerie en flux.

Réponse anti-tumorale et Suivi des tumeurs:

Afin de déterminer si les LT-OT-I traités au TGF-β ont une meilleure réponse anti- tumorale, de par une infiltration plus importante dans la tumeur, 3x106 _{de LT-OT-I(CD45.1)}

traités (+) ou non (ø) au TGF-β ont été transférés par voie intraveineuse à des souris B6 (CD45.2) porteuses d'une tumeur LLC-OVA de 7 à 10 jours. Un jour avant le transfert adoptive, les souris ont été irradiées à 6Gy. Les souris ont été sacrifiées lorsque le volume des tumeurs a atteint 0.5 à 1cm3_{. Le volume des tumeurs a été déterminé en mesurant la longueur}

Activation et étude d'expression génique dans les LT humains:

Tel que décrits dans le chapitre 1 des résultats.

Analyses statistiques

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées avec le logiciel GraphPadPrism (version 5.0, pour Windows, GraphPad Software, La Jolla California USA). Les valeurs de P ont été obtenues soit par des tests de Student non-appariés ou des tests de Wilcoxon appariés, selon l'indication. Toutes les valeurs sont citées ± un écart-type (SEM). Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives à P <0,05.