Matériel et Méthodes

Animaux

Les animaux utilisés dans cette étude étaient des souris femelles issues des lignées H/Rouen et NH/Rouen. Nous avons choisi d’étudier des souris femelles car, tout comme chez l’Homme, les symptômes de la DM sont plus marqués chez les femelles que chez les mâles (El Yacoubi et al., 2013). Tous les animaux ont préalablement été screenés avec le test de suspension par la queue (entre leur 6^ème et leur 8^ème semaine) afin de vérifier leur phénotype respectivement résigné (immobilité supérieure à 115 secondes) ou non résigné (immobilité inférieure à 35 secondes).

Test de suspension par la queue

Le test de suspension par la queue était réalisé avec un système informatisé permettant de tester six animaux simultanément. Les souris étaient suspendues à un crochet par de la bande adhésive (Scotch ^TM) fixée à leur queue. Le crochet était relié à un détecteur de mouvements transmettant les données à un ordinateur. Le taux d'immobilité était quantifié sur une durée totale de 6 minutes. Les souris qui parvenait à s'accrocher à leur queue trois fois pendant la session étaient retirées de l'étude. Toutes les souris étaient isolées pendant 15 minutes avant le test.

Immunofluorescence

Des souris femelles des lignées H/Rouen (n = 4) et NH/Rouen (n = 4) âgées de 12 à 15 semaines ont été profondément anesthésiées par une injection intra péritonéale de pentobarbital sodique (0,2 mL, CEVA Santé animale). Les animaux ont ensuite été perfusés

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avec une solution de ringer lactate héparinée (1mL/L) à température ambiante puis avec 50 mL d'une solution froide (4°C) de paraformaldéhyde (PFA) dilué à 4% dans un tampon phosphate (PB, 0,05 M, pH = 7,4) préparée la veille. Les cerveaux ont été extraits et placés en post-fixation à 4°C dans la même solution de PFA pendant 24 heures à 4°C, puis conservés à 4°C dans une solution cryoprotectrice de sucrose dilué à 30% dans du PB 0,1 M contenant 0,1% d'azoture de sodium jusqu'à leur congélation. Les cerveaux ont ensuite été congelés en les plongeant dans du 2-méthylbutane à -50°C pendant 2 minutes, puis conservés à -20°C pendant 1 semaine au maximum avant leur découpe en coupes coronales de 20μm d'épaisseur à l'aide d'un cryostat (Leica). Les coupes étaient prélevées dans du PB 0,1 M, puis placées à -20°C dans une solution cryoprotectrice composée de 50% de PB 0,1M et de 50% de glycérol jusqu'à l'immunofluorescence. L'étape d'immunofluorescence a été réalisée le même jour sur tous les cerveaux afin de réduire la variabilité du marquage. Les coupes ont été incubées pendant 5 jours à 4°C dans du tampon phosphate salin (0,02 M) contenant 0,3% de triton (PBST), 0,1% d'azoture de sodium, 2% de sérum albumine bovine (BSA) et un anticorps polyclonal dirigé contre la sous-unité GluA1 des récepteurs AMPA (Millipore, référence PC246) dilué au 1:200. Les coupes ont ensuite été incubées 24 heures à 4°C dans du PBST contenant 2% de BSA et un anticorps secondaire couplé au fluorophore Alexa488® (Thermofisher, référence A21206) dilué au 1:500. Les coupes ont été montées entre lame et lamelle dans un milieu de montage contenant du DAPI (VECTASHIELD®, référence H-1200, Clinisciences) puis observées en microscopie confocale. Les photographies ont été acquises sur une épaisseur de 15μm à 17μm avec un pas de 1μm entre chaque image. La densité de marquage GluA1 a ensuite été analysée à l'aide du logiciel ImageJ.

Electrophysiologie

21 souris de la lignée H/Rouen et 19 souris de la lignée NH/Rouen âgées de 8 à 10 semaines ont été utilisées pour l'ensemble de l'étude électrophysiologique. Les animaux étaient profondément anesthésiés par une injection létale intra péritonéale de pentobarbital sodique (150 mg/kg) puis leur cerveau était prélevé. Des coupes coronales de 350 μm étaient réalisées à l'aide d'un vibratome (VT1000S) dans du liquide céphalo-rachidien artificiel (LCRA) à basse température (0-4°C) contenant, en mM : 85 NaCl, 26 NaHCO3, 2,5

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KCl, 1,25 NaH2PO4, 0,5 CaCl2, 4 MgCl2, 25 D-glucose, 75 sucrose. Les coupes étaient ensuite maintenues pendant au moins 30 minutes à température ambiante dans du LCRA (composition, en mM : 124 NaCl, 26 NaHCO3, 1,25 NaH2PO4, 2,5 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 10 D-glucose) oxygéné avec un gaz composé de 95% de CO2 et 5% de O2. Les coupes étaient ensuite transférées dans la cuve d'enregistrement continuellement perfusée avec du LCRA oxygéné (composition, en mM : 124 NaCl, 26 NaHCO3, 1,25 NaH2PO4, 2,5 KCl, 4 MgCl2, 4 CaCl2, 10 D-glucose, 0,1 picrotoxine (PTX)) maintenu à 33°C. La PTX est un antagoniste des récepteurs GABAA, ce qui permet de s'affranchir de la composante inhibitrice des réponses. La forte concentration en magnésium de la solution d'enregistrement avait pour but de compenser l'augmentation d'excitabilité due à la présence de la PTX. En effet, le manque de contrôle inhibiteur associé aux nombreuses connexions récurrentes des réseaux du PFC entraînait une hyperexcitabilité des tranches qui gênait l'analyse des réponses. Pour les expériences s'intéressant aux courants miniatures, le CaCl2 était remplacé par du SrCl2 (4,8 mM), le strontium permettant une désynchronisation des EPSC (Oliet et al., 1996; Xu-Friedman and Regehr, 1999). Les neurones pyramidaux des couches profondes des régions prélimbique et cingulaire antérieure du CPF étaient enregistrés en voltage-clamp (configuration cellule entière) à l'aide d'une micropipette de verre contenant une solution de césium gluconate (Cs-Glu ; composition, en mM : 120 Cs-Glu, 10 HEPES, 10 Na-phospho-créatine, 0,1 CaCl2, 2 MgCl2, 1 lidocaïne, 1 éthylène glycol bis (EGTA), 2 mM adénosine tri-phosphate (ATP)) contenant 0,2% de neurobiotine (Vector Laboratories, référence SP-1120). L'amplitude des courants post-synaptiques excitateurs (EPSC) étaient mesurés en réponse à la stimulation en couches superficielles (couches II/III, voie 1) ou profondes (couches V/VI, voie 2) du CPFm. Des stimulations pairées espacées de 100 ms étaient réalisées sur chaque voie pour toutes les expériences à l'exception de celles réalisées en milieu contenant du Sr²⁺ afin de pouvoir mesurer le paired-pulse ratio (PPR), indicateur de la probabilité de libération présynaptique du neurotransmetteur. L'ensemble des enregistrements ont été réalisé en maintenant le potentiel de membrane des neurones à -70 mV, à l'exception des courants NMDA qui étaient mesurés à un potentiel de membrane de +50 mV. L'amplitude des réponses AMPA était mesurée au pic de l'EPSC, tandis que l'amplitude des réponses NMDA était mesurée 100 ms après la stimulation afin de s'affranchir de la composante AMPA de la réponse (Clem and Huganir, 2010). L'analyse des courants AMPA perméables au Ca²⁺ a été

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réalisée par l'application de 1-Naphthyl Acetyl Sperminetrihydrochloride (NASPM, Tocris) à une concentration de 50 μM.

Révélation des neurones enregistrés

Immédiatement après la fin des enregistrements électrophysiologiques, les tranches étaient placées à 4°C dans du paraformaldéhyde (PFA) dilué à 4% dans du tampon phosphate (PB ; 0,1 M ; pH = 7,2), puis conservées dans du PB à 4°C jusqu'à l'étape de révélation de la neurobiotine. L'étape de révélation consistait en 15 minutes d'incubation des tranches dans du NH4Cl concentré à 50 mM dans du PB, suivi de 1 heure d'incubation dans du tampon phosphate salin (0,02 M) contenant 0,3% de triton, et enfin de 3 heures d'incubation en présence de Texas Red (VectorLab). Les coupes étaient ensuite montées entre lame et lamelle dans une solution composée de 50% de PB et 50% de glycérol, puis observées en microscopie confocale à fluorescence afin de vérifier la nature et la localisation des neurones enregistrés.