CHAPITRE 1- REVUE DE LITTÉRATURE
2. Matériel et méthodes
2.1. Souches de rhizobiums et isolat mycorhizien utilisés
Pour notre étude, nous avons utilisé les souches A2 et S14 d’E. meliloti. Elles proviennent de
la collection du Centre de recherche et de développement sur les sols et les grandes cultures d’Agriculture et agroalimentaire Canada, Québec.
Avant de procéder à nos travaux avec les souches choisies, il était important de vérifier leur pureté. Pour ce faire, nous avons commencé par les inoculer sur le milieu à l’extrait de levure et au mannitol : Yeast Mannitol Agar (YMA) avec Rouge Congo (Annexe A), ce qui nous a permis par la suite d’isoler des colonies uniformes dont les caractéristiques morphologiques ont été confirmées par observation microscopique.
Des spores pures de Rhizophagus irregularis (Ri) DAOM 197198 nous ont été fournies gracieusement par Premier Tech, Rivière-du-Loup.
2.2. Les substrats
2.2.1. Biochar
Le biochar utilisé est de pH neutre, il provient de copeaux de pin dont la pyrolyse a été faite d’une manière rapide et continue à une température de 700 °C (Biochar Solutions Inc, Colorado, États Unis). Ce biochar a été tamisé à 2 mm, ses propriétés physicochimiques sont présentées dans le tableau 2.1.
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Tableau 2.1: Propriétés physico-chimiques du biochar *.
Cendre (%) 8,4 pH 7 CE (mS cm-1) 1,62 C org (%) 76 C inorg (%) 0,45 H/C 0,48 Ntotal (%) 0,45
Masse volumique apparente (g cm-3) 0,08
Ptotal (%) 0,37
Ktotal (%) 20
*Valeurs pour un biochar sec (Taux d'humidité: 12,7 %) ; Source : Soil Control Lab (Watsonville, CA). Masse volumique apparente mesurée au laboratoire de Martine DORAIS, Agriculture et Agroalimentraire Canada, CRIV, Université Laval, Québec, Canada.
2.2.2. Sol
Il s’agit d’un sol prélevé sur le terrain de l’Université Laval en mai 2013. C’est un sol de jachère (loam pH 7; 4,35 % matière organique) qui a été séché, tamisé à 6 mm et mélangé avec de la perlite à raison de 20 % (v/v).
2.3. La luzerne
La variété de luzerne (Medicago sativa L.) utilisée dans cette expérience est la Calypso. C’est la variété recommandée par le Centre de Référence en Agriculture et Agroalimentaire du Québec (CRAAQ) en 2013. Avant le semis, les graines de luzerne utilisées ont été stérilisées en surface (Annexe B) et pré-germées sur de l’eau gélosée à 1,5 % (p/v) pendant une nuit à l’obscurité et à température ambiante.
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2.4. Préparation de l’inoculum d’Ensifer meliloti
Pour obtenir un inoculum destiné à inoculer les graines de luzerne avec les souches de
Rhizobium, le milieu de base utilisé est le milieu à l’extrait de levure et au mannitol : Yeast
mannitol broth (YMB), décrit à l’annexe A.
Nous avons commencé par la préparation d’une pré-culture jeune de la souche A2 ou S14
d’Ensifer meliloti. En effet, dans une fiole Erlenmeyer de 250 ml, 50 ml du milieu YMB ont été déposés stérilement. Par la suite, nous avons ensemencé les 50 ml du milieu liquide avec une anse à partir d’une culture de Rhizobium, sur milieu gélosé YMA où les souches ont été repiquées puis incubées 3 jours à 28 °C. La culture a été faite à 28 °C sous agitation constante à 200 rpm pendant 3 jours.
2.4.1. Cultures de Rhizobium en Erlenmeyer
Un volume de 50 µl de la pré-culture de la souche A2 ou S14 d’Ensifer meliloti a été
transféré dans des Erlenmeyers de 250 ml contenant chacune 50 ml de milieu YMB stérile et nous les avons incubés à 28 °C sous agitation à 200 rpm pendant 3 jours jusqu’à l’obtention d’une suspension bactérienne ayant une densité optique (DO600 nm ) variant entre
0,8 et 1,0 ce qui est équivalent à 66,9 et 74,76 x106 UFC ml-1 pour A
2 et S14 respectivement.
Nous avons prélevé ensuite les 50 ml de cellules, que l’on a lavés 2 fois dans une solution saline stérile NaCl 0,85 %. Pour ce faire, nous les avons centrifugés dans des tubes Falcon stériles de 50 ml contenant chacun 25 ml de cellules. La centrifugation a été faite pendant 5 minutes à 16125 g à 4 °C (Sorval Legend XTR. Rotor F14- 6X 250 LE). Les cellules ainsi prélevées sont ensuite diluées pour produire un inoculum contenant 107 cellules par ml
selon des mesures de DO600 nm.
2.5. Dispositif expérimental
L’expérience a eu lieu dans une chambre de croissance située au Centre de recherche en innovation sur les végétaux (CRIV) de l’Université Laval où les plants étaient soumis à une photopériode de 16 heures avec une température de 20 °C le jour et 15 °C la nuit, une humidité de 70 % et une luminosité de 470 µmol m-2 s-1.
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L’expérience a été réalisée selon un dispositif en blocs complets aléatoires avec 5 répétitions dans des pots de 1 litre (13 cm de diamètre et 11,5 cm de hauteur) contenant le sol amendé ou pas en biochar (15 ou 30 %, v/v). Les différents mélanges ont été incubés pendant une semaine puis chaque pot a reçu 800 spores de R. irregularis DAOM 197198 et 10 graines de luzerne ont été inoculées avec 5 ml d’une suspension bactérienne de 6,69 x107 et 7,47 x107 UFC ml-1 de la souche A
2 et S14 respectivement (Tableau 2.2). Les pots
ont été arrosés une fois par semaine avec une solution nutritive sans azote et avec de l’eau distillée au cours de la semaine. La solution nutritive contenait par litre: 1 ml de K2HP04, 1
ml de KH2P04, 1 ml de citrate de fer, 2 ml de MgSO4 7H2O, 1 ml de CaCl2 et 1 ml d’une
solution d’oligoéléments de Hoagland (Annexe C). Après 16 semaines de croissance (10 % de floraison), la luzerne a été récoltée pour déterminer les masses fraîche et sèche (séchage 3 jours à 60 °C) de la partie aérienne, l’indice de nodulation et le pourcentage de colonisation des racines par les mycorhizes (Annexe D).
Tableau 2.2: Dispositif expérimental de l’expérience de luzerne dans la chambre de croissance
Traitements Description
Ensifer meliloti Aucune inoculation
A2 S14
Biochar de pin 700 °C 0 % 15 % (v/v) 30 % (v/v)
Rhizophagus irregularis 800 spores/ pot de 1 L Nombre de répétitions 5 répétitions
Nombre de pots 3 bactéries X 3 doses de biochar X 5 répétitions = 45 pots
2.6. Analyses statistiques
L’analyse de la variance (ANOVA) et les comparaisons multiples des résultats obtenus pour les masses fraîche et sèche de la partie aérienne, l’indice nodulaire et le pourcentage
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de mycorhization des racines ont été effectués avec la version 9.1 de SAS (SAS Institute, Cary, NC). La normalité des données a été traitée à l’aide de la procédure Univariate et l’homogénéité de la variance des résultats a été vérifiée par l’analyse graphique des résidus. Les moyennes obtenues pour les différents traitements, ainsi que les différences statistiquement significatives (P<0,05 et P<0,1) ont été calculées (test de LSD – la plus petite différence significative).