Marquage spécifique des résidus glycines

Afin de palier le problème de recouvrement des signaux lié à la répétition des triplets POG, nous avons synthétisé sept peptides marqués ¹³C2-Gly ou ¹⁵N-¹³C2-Gly. Pour chaque peptide, une seule glycine est marquée, ce qui permet leur attribution spécifique et l’extraction de paramètres structuraux relatifs à chaque position de la chaine polypeptidique (Figure 17). La synthèse de ces peptides a été réalisée par SPPS et est présentée en partie expérimentale (cf.§C p.74). La convention utilisée pour nommer ces peptides est ⁿ(POG)7, avec n symbolisant la position marquée, (n=1 correspond à la première position dans le sens de la SPPS Cter→Nter).

Figure 17 : Identification des glycines marquées

La glycine marquée est facilement identifiable sur le spectre ¹H,¹³C-HSQC car elle présente d’une part des corrélations beaucoup plus intenses par rapport aux autres signaux qui sont enregistrés en abondance naturelle du ¹³C, et d’autre part, ses corrélations sont dédoublées dans la dimension carbone en raison du couplage entre le carbone C^α et le C’ du carbonyle (¹JC^αC’) (Figure 18). La possibilité d’observer une glycine unique parmi les 7 présentes dans (POG)₇ permet d’obtenir des corrélations plus fines ; il n’y a pas de superposition de plusieurs signaux voisins. En outre, l’optimisation des paramètres d’acquisition nous permet d’augmenter la résolution dans la dimension carbone. Ainsi, pour le CMP marqué ⁴(POG)7, on a pu mettre en évidence deux paires de protons diastéréotopes correspondant au méthylène C^αH₂ de la glycine 12 marquée.

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POG

: POG-POG-POG-POG-POG-POG-POG

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POG

: POG-POG-POG-POG-POG-POG-POG

7

POG

: POG-POG-POG-POG-POG-POG-POG

3

POG

: POG-POG-POG-POG-POG-POG-POG

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POG

: POG-POG-POG-POG-POG-POG-POG

5

POG

: POG-POG-POG-POG-POG-POG-POG

47 La population correspondant au monomère possède des pics de corrélations fins (δ=4,24 et δ=3,95), bien résolus permettant de visualiser la constante de couplage ²JHα2_Hα3

et la population correspondant à la triple hélice a des corrélations plus larges (δ=3,87 et δ=3,74), incompatibles avec l’analyse de leur structure fine.

Figure 18: Spectres ¹H-¹³C HSQC enregistrés sur le peptide (POG)₇ non marqué (spectre bleu) et sur le peptide

4

(POG)7, marqué ¹³C2 (spectre rose). L’optimisation de la résolution permet de mettre en évidence des doublets sur les corrélations les plus intenses dans la dimension ¹³C. 1mM, 500 MHz, 100% D₂O, 5°C

L’enregistrement d’expériences ¹H,¹⁵N-HSQC nous permet également de mettre en évidence la présence de sous-populations (Figure 19). A nouveau, l’intégration des corrélations en fonction de la température nous informe sur l’évolution des populations même si les protons amides subissent des processus d’échange chimique importants à température élevée ce qui ne permet pas d’obtenir des quantifications précises. Nous avons en revanche calculé les coefficients de température pour chacune des populations visibles et nous pouvons voir que seule une population (repérée en orange sur la figure 18) présente un NH engagé dans une liaison H. Ceci confirme l’attribution de la triple hélice établie sur la base des spectres 1D et nous informe par ailleurs que la glycine 12 n’est pas engagée dans une liaison H pour les sous-populations visibles.

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Figure 19: Spectre ¹H,¹⁵N-HSQC, 500MHz, ⁴(POG)7, 10mM, pH=7, H2O/D2O(90:10), 45°C. Trois corrélations ont été attribuées. Elles correspondent à la triple hélice, au peptide monomèrique majoritaire (noté PPII), et à une troisième population notée PPI, pour laquelle la liaison peptidique Gly-Pro est en conformation cis (cf texte pour

davantage d’explications)

Influence de la température – De manière similaire aux analyses 1D présentées

précédemment, l’intensité des corrélations 2D renseigne sur les populations de peptides monomériques ou assemblées en triple hélice. Le gain de résolution associé aux marquages spécifiques et l’édition d’une deuxième dimension (¹³C ou ¹⁵N), nous permet de surcroit d’affiner ces analyses car les populations minoritaires, non visibles en RMN 1D, peuvent à présent être suivies en fonction de la température. Nos premières études ont été réalisées avec un échantillon ⁴(POG)7,c=1mM. Puis, afin d’améliorer la sensibilité tout en limitant le temps d’analyse nous avons réalisé des études avec un échantillon à c=10mM.

Sur les spectres ¹H-¹³C HSQC, nous pouvons voir l’évolution des populations en fonction de la température ainsi que la présence d’une troisième population, notée PPI, impossible à détecter sur la seule base du spectre ¹H (Figure 20). Celle-ci croît de manière identique à la population PPII en fonction de la température, dans un ratio constant de ~20% ce qui est compatible avec une forme monomérique où la glycine éditée est en relation cis vis-à-vis

49 de la proline suivante. Nous retrouverons ce ratio lors de nos études sur le triplet modèle (Pro-Hyp-Gly) qui est présenté dans le chapitre 3.

Figure 20: Evolution des populations M (bleu)/TH (rouge) en fonction de la température pour ⁴(POG)7. Les corrélations repérées par le cadre en pointillé correspondent à une liaison peptidique Gly₁₂-Pro₁₃ en cis.

Conditions : 10mM, pH=7, 500MHz, D₂O

Chacune des populations a été quantifiée en fonction de la température en vue de comparer ces données aux résultats de dichroïsme circulaire et à l’analyse faite en RMN 1D (Figure 21).

Figure 21: Quantification des populations TH et M sur le spectre 1D (•) et 2D █ ) pour le peptide 4

(POG)7, 10mM, pH=7, 500MHz, D2O.

50 Nous observons que les deux approches RMN donnent des résultats similaires en ce qui concerne la quantification. A cette concentration, la triple hélice est toujours présente à 40°C, ce qui coïncide avec la Tm = 39.5°C trouvée par CD (cf. Tableau 1). Cependant, la détermination précise de la Tm par RMN est de 44°C ce qui est sensiblement supérieur à celle trouvée par CD. On note que nous avions également trouvé un décalage de ~5°C sur les études RMN 1D réalisées à 100µM.

Les quantifications obtenues sur les spectres 2D et 1D sont comparables, mais l’avantage de l’expérience 2D est la possibilité de voir les sous-populations.

Influence de la position sur la chaine – L’enregistrement de spectres similaires a été

effectué pour les autres peptides marqués et nous a permis d’établir les attributions précises

1

H, ¹³C et ¹⁵N de chaque glycine en fonction de sa position dans la chaine CMP et de sa forme libre (PPII) ou triple hélice. Il faut souligner que les spectres correspondant à

1

(POG)_{7 ,} ²(POG)₇ et ⁷(POG)₇ sont bien plus complexes car au sein de la triple hélice, les trois chaines PPII sont assemblées de manière décalée le long de l’axe de la triple hélice (décalage d’un résidu entre chaque brin), ce qui conduit à une inéquivalence chimique des trois glycines à chaque extrémité et à une multiplication des corrélations. Les spectres des peptides ³(POG)_{7 ,} ⁴(POG)₇, ⁵(POG)₇, et ⁶(POG)₇ sont en revanche parfaitement superposables même en utilisant l’expérience ¹H-¹³C CH₂-TROSY⁶⁴ (cf 1.5.1) qui permet une augmentation considérable de la résolution dans les deux dimensions ¹³C et ¹H (Figure 21).

Figure 22: Spectres CH₂-TROSY (cf 1.5.1)⁶⁴ centrés sur la zone de déplacement chimique C^αH₂ des glycines, 800MHz, 10mM, D2O, pH=7, 40°C

Pour le peptide ¹(POG)7, nous observons plusieurs populations rassemblées dans une région proche des corrélations obtenues pour les glycines centrales faisant partie de la triple hélice. On distingue principalement quatre populations distinctes dans des

51 proportions (1 ;0.22 ;0.17 ;0.24), ce qui pourrait correspondre au monomère PPII pour la première population et ensuite aux trois brins où chaque glycine marquée se trouve dans un environnement unique en raison de l’inéquivalence inhérente aux décalages des chaînes peptidiques au niveau des terminaisons (cf. Figure 31 qui illustre ce décalage).⁶⁵ De manière attendue, aucune corrélation ne correspond à une fraction PPI car cette glycine n’est pas suivie d’une liaison peptidique.