Les muscles Gastrocnemius et le Plantaris sont prélevés a partir de la cuise dans l’heure qui suit la saigné de l’animal. Les muscle sont maintenue par des aiguilles sur du liège
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est immergé dans une solution de fixation (paraformaldéhyde 1%, glutaraldéhyde 0,1%, sucrose 0,1M, tampon phosphate de sodium 0,1M, pH 7,2) pendant 15 min.
Les muscles sont ensuite rincés trois fois dans du PBS (Phosphate Buffer Saline : KH2PO4 à 1,5 mM, Na2HPO4 à 8 mM, NaCl à 137 mM, KCL à 2,7 mM, pH 7,4) pendant 5 min. Puis incubés avec de l’AnnexinV marqué au FITC (Sigma-Aldrich A9210, Saint-Quentin Fallavier, France) dilué au 1/150ème dans du tampon PBS (concentration finale de 1,8 µg/ml) pendant 24 h à 4°C avec une agitation douce.et à l’abri de la lumière.
La rat est conservé dans un bain marie entre 8 à 10 C pendant 7 h post mortem. Ensuite conservé à 4 °C jusqu’au le lendemain pour le prélèvement de 24 h post mortem. Les même muscle sont prélevé et traités de la même manière et dans des conditions semblable que le prélèvement 1 h post mortem
Les témoins sont effectués dans les même conditions en incubant un muscle de la cuise à 1h et un autre à 24 h post mortem dans une solution de PBS sans AnnexinV
Après les 24 h d’incubation avec l’AnnexinV les muscle sont rincés trois fois dans du PBS (Phosphate Buffer Saline : KH2PO4 à 1,5 mM, Na2HPO4 à 8 mM, NaCl à 13,7 mM, KCL à 2,7 mM, pH 7,4) pendant 5. Les muscle sont découpés en dés de 2 à 3 cm de coté, les morceaux du muscle sont fixés sur un moule de liège adapté à la taille de notre échantillon à l’aide d’une résine qui va durcir à la congélation (Tissutech chez Labonord). Cette résine étant fluide à température ambiante. Ensuite les échantillons sont congelé à -160°C dans de l’isopentane (Prolabo) refroidi dans de l’azote liquide pendant 1 à 2 min selon la grosseur de l’échantillon.
Des coupes transversales de 10µm d’épaisseur ont été réalisées avec un microtome Microm HM5M. Les coupes sont séchées à l’air libre mais à l’abri de la lumière. Ensuite fixées pendant 15 min avec une solution PBS contenant 2% de formol. Trois rinçages de 5 min avec du PBS, les lames sont égouttées. Des gouttes d’agent Aqueous Mounding Medium comme liquide de montage sont rajoutées entre lame et lamelle. On laisse sécher et on observe au microscope Nicon Labphot2 les observations sont faite à une a une longueur d’onde excitation ʎexc 488 nm et a une longueur d’onde d’émission ʎemm 530 nm. Les images sont visualisés à l’aide d’une caméra relier à un ordinateur le logiciel utiliser pour la capture des images est VISILOG. La présence ou l’absence de marquage étaient les seuls critères d’évaluation.
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90 5.2. Le double marquage à la laminine
Le marquage à la laminine se fait directement sur des coupes transversales des muscles déjà marquées à l’annexinV FITC préparer de la même manière que pour le marquage à l’annexinV ‘(voir page 72). Toutes les étapes de ce marquage sont faites à l’abri de la lumière pour éviter la perte du premier marquage à l’FITC.
Après séchage et fixation et rinçage des coupes, les sites non spécifiques sont saturés par une solution de PBS contenant 10% de sérum de chèvre (Sigma S2007) pendant 30 min. Après lavage, les coupes sont incubées en chambre humide avec le premier anticorps dirigé contre la laminine produit chez le lapin (Sigma L9393) dilué au 1/100ème dans une solution de PBS pendant 1h à température ambiante. Trois rinçage de 10 min chacun sont ensuite effectués avec du PBS. Enfin le deuxième anticorps anti IgG de lapin marqué à la cyanine 3 (produit chez la chèvre Santacrouz SC-58797) est utilisé à la dilution de 1/150ème l’incubation a lieu à température ambiante durant 1h. De nouveau il faut procéder à 3 lavages PBS pour éliminer les anticorps marqués non fixés. Des gouttes d’agent Aqueous Mounding Medium comme liquide de montage sont rajoutées entre lame et lamelle. On laisse sécher et on observe au microscope Nicon Labphot2. les observations sont faite à une a une longueur d’onde exitation ʎexc 554 nm et a une longueur d’onde d’émission ʎemm568 nm Les images sont visualisés à l’aide d’une caméra relier à un ordinateur le logiciel utiliser pour la capture des images est VISILOG.
5. 3. Microscopie électronique
Pour l’étude de L’ultrastructure du muscle. Les coupes ont été faites sur le muscle longissimus de rat. Les coupes ont été traitées selon le protocole décrit par VignonX., Beaulaton J. Et Ouali A., 1989
6..LA MISE EN EVIDENCE DE LA FRAGMENTATION D’ADN DANS LES CELLULE MUSCULAIRE
La Fragmentation de l'ADN a été suivie par immunhistochimie grâce à l'utilisation d'un anticorps monoclonal dirigé contre ces fragments et disponible dans le commerce anti-ssDNA/APOSTAIN.
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91 6. 1. Principe de la méthode :
Des coupes minces ont été préparées comme décrit ci-dessus et coloré en utilisant la méthode traditionnelle de Hematoxylin / érythrosine.
Le test présenté ici est basé sur la sensibilité accrue de l’ADN à la dénaturation thermique chez les cellules apoptotiques. Cette méthode permet la dénaturation de l’ADN par chauffage à 56 °C en présence de formamide, et son marquage par l'anticorps monoclonal (Mab F7-26) spécifique de l'ADN simple-brin (ADNsb).
Des coupes minces ont été préparées comme décrit ci-dessus (voir cf 5.1.) et coloré utilisant la méthode traditionnelle de Hematoxylin / érythrosine. L'ADN réduite en fragments a été indiquée en utilisant un anticorps monoclonal (apostain, AbCys SA, Paris) identifiant les fragments spécifiquement de l’'ADN simple-brin caractérisant les cellules apoptotic. Ce marquage a été effectué conformément à la recommandation du fabricant.
6.2. Préparation des échantillons
Après anesthésie du rat avec du pentobarbital sodique 0,1ml/100g de rat in intra-péritonial. Le prélèvement d’un morceau de muscle longissimus dorsi sous anesthésie puis après saignée de l’animal, à différents temps post mortem (15, 30 min et 1, 2, 4, 7, 24 et 48h.). Le rat est conservé à température ambiante les 7 premières heures. Enlèvement de l’appareil digestif après le premier prélèvement après saignée. Dégagement du muscle au fur et à mesure des prélèvements pour éviter de dessèchement.
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Chapitre 3. INHIBITION DE CASPASES INITIATRICES ET EXECUTRICES PAR
LES bovSERPINA3-1 ET A3-3 1. Titration et mesure de l’activité enzymatique
1. 1. Préparation des enzymes
La trypsine se présente sous forme de poudre et est reprise dans un tampon Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, CaCl2 10 mM.
La caspase-3 et la 8 sont préparées dans un tampon HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, CHAPS 0.1 %, Sucrose 10 % auquel est ajouté extemporanément du DTT 10 mM.
1. 2. Titration des enzymes
1. 2. 1. Titration de la solution de trypsine utilisée
La trypsine est titrée en utilisant du 4-nitrophényl-p-guanidinobenzoate (NPGB) selon la méthode décrite par Chase et Shaw (1970). Les sérine protéinases sont particulièrement faciles à doser car elle ont l’avantage de former, lors du processus catalytique, un intermédiaire qui est une acyl enzyme. Cet acyl enzyme est ensuite hydrolysée en acide et ensyme. Si cette hydrolyse est très lente, l’alcool libéré lors de la formation de l’acyl enzymz est équivalent au nombre de moles d’enzymz active que l’on peut déduire en mesurant l’absorbance de l’alcool chromogénique formé.
Enzyme + Substrat ES AcylEnzyme + Alcool Acide + Enzyme Le substrat de la trypsine utilisé est le p-NPGB (p-nitrophényl-p’Guanidinobenzoate HCL) (Sigma). Ce substrat est choisi préférentiellement car l’acyl-enzyme formée lors du processus catalytique est particulièrement stable. La poudre de p-NPGB est dissoute dans du dimethylformamide et la solution obtenue, pour être plus stable, est diluée dans 4 volumes d’acétonitrile (concentration finale 0,01 M). Le p-NPGB ainsi préparé peut être conservé plusieurs semaines à 4°C.
Dans une microcuve, 100µl d’une solution de trypsine, préparé 2mg/ml à l’aide d’un tampon Tris-HCL 50mM, CaCl2 0,02 M, pH 8, sont dilués avec 890 µl de tampon véronal, pH8,3, après mélange 10µl de la solution de NPGB sont ajouté dans la microcuve. Le p-NPGB réagit avec la trypsine et alcool formé, le p-nitrophénol, donne à la solution une
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couleur jaune visible d’ont l’absorbance est mesurée à une longeur d’onde de 480nm à l’aide du spectrophotomètre Uvikon 860 (Kontron).
La mesure est réalisée contre une référence qui contient 100µl de tampon sans trypsine, 890 µlde tampon véronal et 10µl de substrat.
La molarité du p-nitrophénol produit peut être calculée selon la formule : [p-Nitrophénol]=DO x 6,025 10-5x10
Où DO représente la densité optique du p-nitrophénol libéré, 6,025 10-5 le coefficient d’extinction molaire du p-nitrophénol, et 10 le facteur de dilution de la trypsine. La molarité du p-nitrophénol produit permet de déduire la molarité de trypsine active
1. 2. 2. Titration de la caspase 3 et 8
La caspase 3 (EC 3.4.22.B9) provient de chez sigma est titrée avec l’inhibiteur irréversible Z-Asp-Glu-Val-Asp-chloromethylketone et la caspase 8 (EC 3.4.22.B12) provient de chez Sigma est titrée avec l’inhibiteur irréversible Z-Val-DL-Asp-fluoromethylketone, les inhibiteur proviennent de chez Bachem.
Les caspases sont titrées selon la méthode de Stennicke et Salvesen (1999). Les caspases 3 et 8 sont repris dans un tampon HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, CHAPS 0,1 %, sucrose 10 % auquel sont ajoutés 10 mM de DTT au moment de son utilisation.
La quantité (0,136 mg/ml) de la poudre de la caspase 8, diluée 8 fois, est utilisée à une concentration de 5,66 x 10-7 M. Une solution à 5 nM de l’enzyme sera titré par une gamme de dilution de l’inhibiteur irréversible Z-Val-DL-Asp-fluoromethylketone. Après une préincubation de 5 minutes à 25°C , 50 µL du substrat N-Acetyl-ASP-Glu-Val-Asp-NHmec à 100 µM est ajouté. la Lecture de la fluorescence pendant 5 à 10 minutes à une longueur d’onde d’excitation de 360 nm et une longueur d’onde d’émission de 440 nM.
La concentration de la caspase 3 est de 0,29 mg/ml elle est diluée 10 fois avec tampon HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, CHAPS 0,1 %, sucrose 10 % auquel sont ajoutés 10 mM de DTT au moment de son utilisation. Donc la molarité de la caspase 3 est de 9,6 10-7M. Une solution de 5 nM de la caspase 3 est titré avec un gamme de dilution de
Figure 29. Exemple de titration de la caspace 3 par l’inhibiteur irréversible Z-Asp-Glu-Val-Asp-chloromethylketone
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l’’ihibiteur (Z-Asp-Glu-Val-Asp-chloromethylketone) allant de 0 a 50 µM le en estime Après une préincubation 5 minutes à 25°C , 50 µL du substrat N-Acetyl-ASP-Glu-Val-Asp-NHmec 100 µM est ajouté. la Lecture de la fluorescence pendant 5 à 10 minutes à une longueur d’onde d’excitation de 360 nm et une longueur d’onde d’émission de 440 nM.
Le calcule de la concentration de l’enzyme active dans notre solution est déterminé par la formule : figure 29
[E]active = [I] (VI/VE) facteur de dilution Où [E]active : concentration réelle de l’enzyme active (en nM)
[I] concentration de l’inhibiteur (pour notre exemple nous avons 9,06 nM) VI : volune de 20µl des différentes dilutions de l’inhibiteur
VE : volume de l’enzyme de 30 µL
La concentration moyenne des caspases après titration est de 884,48 ± 232,48 nM 1. 3. Mesure des activités enzymatiques
L’activité des deux enzymes est mesurée en suivant l’hydrolyse d’un substrat synthétique fluorescent. La fluorescence du 7-amino-4-méthylcoumarin (AMC), libérée après hydrolyse du substrat de la trypsine ou de la caspase, est mesurée à une longueur d’onde d’émission de 440 nm après excitation à 360 nm.