Les caspases et l’apoptose en science de la viande

La mort programmée de cellules (apoptose) a été intensivement étudiée dans les cellules qui contiennentt un seul noyau, mais que se passe-t-il avec des cellules qui contiennent plusieurs noyaux comme dans la cellule musculaire mature?. L’occurrence de l’apoptose dans les cellules musculaires est controversée dans la littérature courante. Cependant l’évidence suggère que l’apoptose est une caractéristique de la cellule musculaire (Sandri et Carraro, 1999 ; Adams et al., 2001 ; Liu et Ahearn, 2001 ; Primeau et al., 2002 ; Sandri, 2002 ; Tews, 2002, 2005 ; Leeuwenburgh, 2003 ; Yuan et al., 2003). En accord avec ce rapport, l’expression de différentes caspases (caspases-1, -3, -6, -8 et -9…) et de divers régulateurs de l’apoptose (activateurs ou inhibiteurs) a été vérifiée dans les cellules du muscle squelettique (Biral et al., 2000 ; Belizario et al., 2001 ; Jin et al., 2001 ; Sandri et al., 2001).

La mort dans un tissu vivant peut se produire par nécrose ou apoptose. Puisque la nécrose n’a jamais été rapportée dans le muscle post mortem, le déclenchement de la mort cellulaire par le processus apoptotique est l’issue la plus probable. Quelque soit l’espèce animale et quelle que soit la technologie d’étourdissement utilisée, la dernière phase du processus d’abattage est la saignée. Dès lors, toutes les cellules et les tissus vont être irréversiblement privés de nutriments et d’oxygène. Face à ces conditions environnementales très néfastes, les cellules musculaires et les autres n’auront pas d’autre alternative que de s’engager sur la voie du suicide avec toutes les conséquences de l’apoptose.

Mais qu’a pu être la voie de signalisation menant à l’apoptose des cellules après la saignée ? Une possibilité serait un changement irréversible dans les myofibrilles à la jonction neuromusculaire où des activateurs de la cascade apoptotique pourraient être produits. Une telle prétention est soutenue par la diminution rapide de l’efficacité de la stimulation électrique de basse tension (Valin, 1982) qui résulte d’un changement post mortem rapide du

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système nerveux, le conducteur principal du courant de basse tension (Chrystall et Devine, 1985). De même, la dénervation a été montrée capable d’induire l’apoptose dans le muscle squelettique, un processus souvent lié à une fragmentation des myofibrilles (Sandri et Carraro, 1999 ; Adams et al., 2001 ; Liu et Ahearn, 2001). Une autre hypothèse de l’induction de l’apoptose dans le muscle post mortem pourrait être le dysfonctionnement des mitochondries (détérioration de la chaîne oxydante, augmentation intracellulaire de la concentration de radicaux libres, …) se produisant peu après la mort (Machlin et Bendich, 1987 ; Halliwell, 1991 ; Renerre, 1999). En effet, le changement des mitochondries pourrait être un autre initiateur de l’apoptose par la libération des facteurs proapoptotiques comme le cytochrome c (Adrian et Martin, 2001). Ce sont deux voies possibles menant à l’apoptose dans le muscle post mortem mais d’autres voies peuvent exister (Hirsch et al., 1997 ; Susin et al., 1999 ; Hengartner, 2000 ; Torriglia et al., 2000 ; Van Gurp et al., 2003). En ce qui concerne la science de la viande, rien n’est connu au sujet des mécanismes moléculaires de l’apoptose, mais cette étape préliminaire pourrait être d’importance cruciale dans le muscle post mortem puisque tous les changements suivants qui contribuent à la conversion du muscle en viande dépendront fortement de cet événement.

CONCLUSION

Le défi principal de la science de la viande est d’identifier les marqueurs biologiques de la tendreté qui permettront la classification des carcasses dans des groupes de qualité et l’ajustement des prix à la qualité prédite.

La plupart de programmes de recherche sont limités aux calpaïnes puisque elles sont considérées comme les principaux intervenants dans le processus enzymatique qu’est la maturation de la viande. En ce qui concerne la texture de la viande on doit considérer non seulement les enzymes protéolytiques mais également leurs inhibiteurs endogènes, qui sont souvent de meilleurs marqueurs prédictifs de cette qualité de la viande que les peptidases elles-mêmes (Zamora et al., 2005). A la lumière des données disponibles dans la littérature une série de nouveaux systèmes protéolytiques et de leurs inhibiteurs ont été pris en considération et la recherche actuelle doit être focalisée aussi sur les autres systèmes que ceux seulement des calpaïnes et cathepsines ; par exemple les serpines (inhibiteurs de sérine protéinases), les caspases qui sont des enzymes jamais considérées dans la science de la viande et qui sont spécialisées dans la dégradation des structures cellulaires.

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Par ailleurs, si les inhibiteurs de protéinases ont fait l’objet de plusieurs investigations au niveau des tissus de mammifères, très peu de données sont actuellement disponibles concernant le tissu musculaire.

Cette thèse s’insère dans une étude globale qui vise à mieux comprendre les relations qui lient les différents paramètres physico-chimiques et biochimiques intervenant dans le processus d’attendrissage naturel de la viande d’agneau. La deuxième partie de notre travail été orienté vers la mise en évidence de l’apoptose dans le muscle, Pendant les premières heures de la transformation du muscle en viande, phase considérée depuis des décennies comme une étape essentielle de l’attendrissage. Cette phase visera à suivre et à caractériser l’entée en apoptose du muscle de rat. Une troisième patie sera concacrée essentiellement a mesurer des cinétiques enzymatiques et, plus particulièrement, à la détermination des constantes d’association caractérisant la vitesse d’interaction des serpines avec leurs protéases cibles. Pour essayer d’identifier ces derniers et de préciser la nature de leurs protéases cibles in vivo, protéases susceptibles de jouer un rôle primordial dans le processus d’attendrissage des viandes.

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Préambule

Rappelons que notre travaille comporte trois parties :

Le but de la première partie de notre travail est l’étude des paramètres physico-chimiques et biophysico-chimiques intervenant dans le processus d’attendrissage naturel de la viande ovine. Pour atteindre cet objectif nous avons mesuré plusieurs caractéristiques biologiques connues pour avoir un rôle dans le processus d’attendrissage au niveau de quelques muscles d’ovins de même race, Ouled Djellel, et d’âge similaire.

Donc le premier objectif de notre travail était l’identification des paramètres physico- chimique et biochimique principalement responsables de la maturation de la viande d’agneau. Mais nous avons été confrontés à plusieurs problèmes d’ordre pratique. De nombreuses mises au point de techniques on été adaptées aux moyens disponibles au laboratoire. La méthodologie ainsi que les résultats concernant la mise au point des techniques seront présentées dans la première partie du chapitre résultats et discussions. Les techniques déjà connues et qui n’ont pas nécessité de mise au point seront détaillées dans le chapitre matériels et méthodes.

Nous avons pu caractérisée la viande d’agneau par le suivi de l’évolution de la dureté et des paramètres physicochimiques (pH, osmolarité, rétention d’eau) dans différents muscles d’agneau en relation avec les caractéristiques métaboliques de ces mêmes muscles estimées par immunochimie ainsi que la dégradation des protéines myofibrillaires au cours du stockage qui a été estimée par électrophorèse en conditions dénaturantes.

La deuxième partie de notre travail était orientée sur l’étude des premières heures de la transformation du muscle en viande, phase considérée depuis des décennies comme une étape essentielle de l’attendrissage. Cette phase visera à apporter des preuves de la mise en place du processus de mort par apoptose dans le muscle post mortem. Nous avons en effet émis l’hypothèse que la phase, très mal définie, que l’on désignait jusque là sous le nom de phase pantelante pourrait correspondre à la mise en place du processus d’apoptose. Cette mise en place du processus apoptotique s’accompagne de changements très caractéristiques dont les principaux sont :

§ Inversion de la polarité de la membrane en relation avec l'évolution du pH, ce point sera étudié en histochimie grâce à l'utilisation d'une protéine marquée au FITC (Annexin V

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Fluoroscéine- isothiocyanate) et qui possède une très forte affinité vis-à-vis des groupements phosphatidylserine. Un suivi du pH sera fait en parallèle afin vérifier la relation entre la translocation des phospholipides et les phases de stabilité du pH.

§ Altération des mitochondries avec libération du cytochrome c: l'apparition du cytochrome c dans le cytosol des cellules pourra être suivi par western blot, à l'aide d'un anticorps dirigé contre le cytochrome c. Cet anticorps a été préparé en utilisant, comme antigène, du cytochrome c commercial.

§ Les caspases: un suivi de l'apparition des différentes caspases à êté réalisé par western blot sur des extraits musculaires prélevés à différents temps post mortem grâce à des anticorps préparés au laboratoire sur des lapins.

§ Fragmentation de l’ADN : l'apparition de fragments de tailles uniformes peut être suivie par immunohistochimie grâce à l'utilisation d'un anticorps dirigé contre ces fragments et disponible dans le commerce.

Toutes ces modifications associées à l'apoptose vont influer de façon considérable sur le processus de maturation des viandes. Plus le processus de mort cellulaire sera intense et complet (déstructuration du muscle maximale), plus la viande sera tendre. Ceci montre l'importance capitale de cette phase.

La troisième partie de notre thèse a été réalisée, pendant mes différents séjours en France, en collaboration avec Carlos HERRRA-MENDEZ, étudiant Mexicain en thèse a l’INRA de Theix-Clermont Ferrand pour la préparation de sa thèse, et Xavier BLANCHET, étudiant en thèse au Laboratoire de Génétique moléculaire Animale à l’Université de Limoges. Ce travail en commun est l’aboutissement de plusieurs années de recherches engagées au niveau du laboratoire sur l’identification des inhibiteurs de sérine protéinases détectées dans le muscle de bovin. Dans le contexte de la viande, ces inhibiteurs étaient d’autant plus importants que leurs concentrations dans le tissu musculaire se sont avérées être le meilleur indice de prédiction de la tendreté de la viande et, cela, parmi une trentaine de variables mesurées (Zamora et al., 2005).

Ces observations ont conduit à une étude plus systématique des inhibiteurs de serine protéases dans le tissu musculaire pour essayer d’identifier ces derniers et de préciser la nature de leurs protéases cibles in vivo, protéases susceptibles de jouer un rôle primordial dans le processus d’attendrissage des viandes. La purification, la caractérisation et la

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quantification de trois serpines musculaires ont été réalisées dans le cadre de la thèse de Herra-Mendez (1996). Par séquençage N-terminal, deux de ces inhibiteurs ont été identifiés comme étant des endopines dénommées initialement endopines 1A et 1B (Herrra-Mendez et al., 2006) puis bovSERPINA3-1 et A3-3 par Pélissier et al (2008). La troisième serpine a été identifiée comme étant l’antithrombine III.

Leurs propriétés physicochimiques et leurs activités vis-à-vis d’une série de serine et de cystéine protéases ont fait l’objet de deux publications (Tassy et al., 2005; Herrra-Mendez et al., 2006). Les séquences des deux serpines purifiées ont été obtenues par nos collègues de l’université de Limoges (Unité de Génétique Moléculaire Animale, UMR1061 INRA-Université, Univ. de Limoges) qui ont identifié et séquencé les gènes codant pour ces protéines. Ce travail a permis de montrer que ces deux serpines de la famille des endopines faisaient en fait partie d’un groupe très homologue de serpines comprenant au moins 8 membres (Pelissier et al., 2008).

Ces travaux ont conduit à la production de serpines recombinantes et en particulier la bovSERPINA3-3. Dans le cadre de la thèse de Xavier BLANCHET, Université de Limoges, des mutations ont été réalisées sur cette protéine pour identifier le site de clivage ciblé par les caspases lors de leur inhibition. La disponibilité des protéines recombinantes permettra une étude plus détaillée des relations structure-fonction de ces protéines et de leur mode d’inhibition des caspases. Ces protéases possédent deux sites actifs contrairement à toutes les serine et cystéine protéases testées jusque là.

Ma contribution à ces travaux a consisté à caractériser les cinétiques d’interaction (détermination de kass) des bovSERPINA3-1 et A3-3 purifiées à partir de muscles et des formes recombinantes sauvages ou mutées, avec les caspases initiatrices (caspase 8) et exécutrices (caspase 3) humaines prises pour modèle. Ce travail à été publié dans le Journal FEBS Letters en 2009. La séquence des serpines utilisées dans ce travail (bovSERPINA3-1 et A3-3) ainsi que la méthode utilisée pour déterminer la constante d’association (kass) des serpines avec les caspases 3 et 8, a été publiée en document complémentaire avec l’article et inclus dans le chapitre correspondant.(Supplemental data file Chapitre 4 partie résultats et discussion).

Etudes expérimentales chapitre 1 : Caractérisation physicochimique et biochimique de la viande d’agneau

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Chapitre 1 : CARACTERISATION PYHYSICO-CHIMIQUE ET BIOCHIMIQUE DE LA VIANDE D’AGNEAU

1.MATERIEL BIOLOGIQUE

1.1. Animaux

Pour étudier la variabilité de l’attendrissage de la viande liée au facteur animal, et type de muscle nous avons utilisés cinq agneaux de la race Ouled Djellel qui proviennent du même producteur (ferme pilote, Kadri 4 chemin Constantine) afin d’être zootechniquement homogènes. Ces animaux sont âgés de 11 à 13 mois et leur poids de carcasses varie entre 11 et 16 kg, avec une moyenne de 12,68kg.

1. 2. Muscle

Pour les cinq agneaux les muscles étudiés sont : Muscle Semi Membranosus (SM), Muscle Semi Tendinosus (ST), Muscle Longissimus lumborum (LB) et le muscle Rectus Femoris (RF).

1. 3. Abattage et prélèvement des échantillons

L’abattage des cinq agneaux ces faits au niveau de l’INATAA selon le rite musulman, les animaux sont transportés la veille de la journée du travail pour éviter le stress du transport. Les muscles sont prélevés immédiatement après l’abattage, ils sont découpés en neuf tranches d’épaisseurs égales.

Une tranche a été immédiatement plongé dans de l’azote, afin de servir au mesure de certains paramètres biochimiques à savoir le dosage de la teneur en myoglobine pour estimé le métabolisme oxydatif, et la teneur en isoformes M4 de l’enzyme LDH pour caractériser le métabolisme glycolytique des muscle au stade d’abattage. Cette tranche a également servie au dosage du collagène du muscle afin d’estimé la dureté de bases des différents muscles étudier. Ces dosages ont été réalisés au laboratoire Biochimie et Protéines Musculaire de la station de recherche sur la viande INRA de Theix.

Les huit tranches qui restent sont emballées dans des sachets en polyéthylène. A part les tranches utilisées pour la première analyse, les autres tranches sont placées dans un bain d’eau à 12°C de façon à éviter le « cold-shortening ». Le lendemain (24 h post mortem), les échantillons sont transférés dans un bain à 4°C et stockés ainsi jusqu’à 48 h post mortem.

Etudes expérimentales chapitre 1 : Caractérisation physicochimique et biochimique de la viande d’agneau

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Les paramètres sont étudiés en cinétique aux temps suivants : 1, 4, 6, 8, 10, 12, 24 et 48h post mortem. Pour chaque temps de prélèvement, nous avons répété les mesures trois fois pour tous les paramètres sauf pour la mesure de la tendreté au pénétromètre qui à été faite cinq fois.

Les paramètres mesurés en cinétique sont la température, le pH, la conductivité électrique, et la capacité de rétention d’eau des protéines myofibrillaires, les degrés de protéolyse par le suivi du profile électrophorétique, et également la mesurer de la dureté par pénétromètre. Ces mesures ont été faites au laboratoire de l’INATAA ainsi que au laboratoire de biochimie et Génétique station l’amélioration des plantes.

2.METHODES PHYSICOCHIMIQUES