Maintenir la solubilité du collagène en suspension

Dans cette partie, nous allons proposer des méthodes envisageables pour maintenir la solubilité du collagène. Celles-ci sont reposent sur les interactions entre les molécules de collagène que sont les liaisons hydrogène et les ponts salins.

Liaison hydrogène

Dans l’objectif de mieux comprendre le mécanisme de fibrillogenèse, Kuznetsova et ses collaborateurs ont montré que l’ajout de polyols peut grandement affecter les forces d’attraction et ainsi la solubilité du collagène. Ces travaux ont permis de mettre en évidence les types d’interactions impliqués dans le mécanisme d’auto-assemblage des molécules. Les polyols sont des molécules riches en groupements hydroxyls et les sucres au sens large en font partie. Ces molécules seraient en compétition avec les molécules d’eau et perturberaient ainsi les liaisons hydrogène impliquées entre les molécules de collagène. Ces polyols ont des effets différents sur la cinétique d’agrégation en fonction de leur stéréochimie. Parmi ces molécules, certaines comme le 1,3-propane diol inhibe fortement la cinétique alors que le 1,2-propane diol l’inhibe faiblement. Parmi les molécules à la fois biocompatibles et

142

inhibitrices de la fibrillogenèse en favorisant la solubilité du collagène, nous comptons par ordre décroissant : le fructose, le glucose, le sorbitol et le glycérol (Figure IV. 26).128

Figure IV. 26 : Solubilité du collagène à 32 °C, pH 7.4, 10 mM de phosphate de sodium, 0.13 mM NaCl en présence de solutés. Les échelles sont linéaires (a) et logarithmiques (b). Figure issue de Kuznetsova et al.,128

Ponts salins

Les anions de sulfate et de phosphate sont présents au niveau de l’espace extracellulaire à des concentrations de quelques mM (1 à 3 mM). Ces ions jouent un rôle important dans la formation et les propriétés de la matrice extracellulaire. Ils ont un effet sur la fibrillogenèse du collagène1, sont impliqués dans les interactions avec d’autres composants de la matrice extracellulaire notamment entre les glycosaminoglycanes et le collagène2 et sur les propriétés mécaniques de la matrice3.

Ces ions peuvent s’accumuler au sein des fibrilles de façon liée aux molécules de collagène mais sont également retrouvés dans l’espace interstitiel sous formes d’ions libres.

Il a été mis en évidence que seuls les anions divalents forment des ponts salins avec les groupements chargés positivement des acides aminés du collagène. Ces ions perturbent également l’agencement des fibrilles en modifiant les distances entre les micro-fibrilles et non entre les molécules de collagène au sein de la microfibrille. Les sites les plus probables seraient les résidus chargés positivement des lysines et arginines4.

Il a été montré que l’ajout de phosphate et de sulfate augmente le temps de latence de la fibrillogenèse et la solubilité du collagène. D’après la Figure IV. 27, la solubilité du collagène augmente exponentiellement avec la concentration en anions divalents pour les trois valeurs de pH et l’effet stabilisant du sulfate est d’autant plus important. Au vue de ces données, nous nous proposons d’étudier l’instabilité capillaire des jets libres de collagène en présence des ions phosphate et sulfate à 30 mM.

143

Figure IV. 27 : Solubilité du collagène en fonction de la concentration en phosphate et sulfate dans 130 mM NaCl, 10 mM HEPES à 32 °C. Les courbes de solubilité normalisées ln s/s0 coincident pour le phosphate et le sulfate à tous les pH lorsqu’elles sont tracées en fonction de la concentration en anions divalents, suggérant que le phosphate monobasique n’a pas d’effet sur la solubilité. Figure issue de Kuznetsova et al.,128

D’après la littérature, nous disposons de deux méthodes pour maintenir la solubilité du collagène à pH neutre soit favoriser les liaisons hydrogènes soit les ponts salins. Nous avons alors testé celles-ci en réalisant des cinétiques d’agrégation du collagène en présence de fructose à 200 mM et en présence d’un excès de sulfate de sodium dibasique à 30 mM. Ces concentrations ont été déterminées tout en respectant l’osmolarité physiologique de la solution. Les cinétiques sont représentées à la Figure IV. 28.

144

Figure IV. 28 : Cinétique d’agrégation du collagène. Variation de l’absorbance mesurée à 340 nm au cours du temps d’une solution de collagène à pH 6.8 en présence de tampon phosphate salin (), de 200 mM de fructose () et de 30 mM de sulfate de sodium dibasique ().

En comparant les cinétiques d’agrégation du collagène dans du PBS (qui constitue la condition de référence) et en présence de fructose, nous remarquons que le temps de latence est retardé approximativement d’une heure (Figure IV. 28). Cependant ce temps de latence reste plus court que celui observé en présence d’excès d’ions sulfate de sodium dibasique qui est approximativement de 4 heures. Nous avons vu également que le phosphate de sodium peut également maintenir le collagène soluble, tout comme le sulfate de sodium. Nous avons alors choisi de comparer l’effet de ces deux ions. A la Figure IV. 29, nous avons reporté les résultats de la densité de probabilité de la longueur de fragmentation des jets contenant du collagène en présence de ces sels. Nous remarquons que la taille du jet contenant le sel de sulfate est plus grande que celui qui contient du phosphate. Par ailleurs, nous notons que les tailles moyennes des jets contenant le collagène en présence de sulfate et du collagène dilué dans de l’eau sont très proches. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 2 4 6 8 10 12 14 Exces sulfate Fructose PBS

Tu

rb

id

it

é

(U

A

)

Temps (heures)

145

Figure IV. 29 : Mesure de la longueur de fragmentation des jets libres de différents fluides. Fluides : Collagène dilué dans de l’eau à pH acide, en présence d’ion sulfate de sodium et de phosphate de sodium à pH neutre.

Finalement, nous avons décidé de retarder l’agrégation du collagène en favorisant la formation de ponts salins par l’ajout d’ions sulfate de sodium dibasique à 30 mM.