Le collagène

Diversité et composition

Les protéines de collagène appartiennent à la famille des protéines fibreuses et sont retrouvées chez tous les organismes multicellulaires. Elles constituent le composé majoritaire de l’armature des os, des ligaments et de la peau (derme). Le collagène représente 25 % (en masse sèche) de la masse protéique totale chez l’animal.95,96 Il existe plus d’une vingtaine de types qui se différencient principalement par leur localisation et leur fonction physiologique.97

Dans ce manuscrit, nous nous sommes focalisés sur la protéine de collagène de type I, qui représente 90% de l’ensemble des protéines de collagène. Le collagène de type I est le composant majoritaire de la matrice extracellulaire des tissus conjonctifs. Il est constitué d’une séquence répétitive des acides aminées [Gly-X-Yn] où les acides aminés en position Xaa et Yaa sont souvent une proline (Pro, 28%) et une 4-hydroxyproline (Hyp, 38%) respectivement. Ainsi ProHypGly est le triplet le plus abondant (10,5%) au sein de la molécule de collagène.98 Les structures chimiques de ces acides aminés sont illustrées à la Figure IV. 5. Dérivée de la proline, l’hydroxyproline est un acide aminé qui a subi une hydroxylation sur le cycle pyrrolidine en position 4.99

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Figure IV. 5 : Structure chimique de la proline et de la glycine. Les groupements chimiques encerclés représentent les groupements latéraux. Image issue de Biochemistry, Seventh Edition© 2012 W.H. Freeman and Company.

Le radical de la proline et de l’hydroxyproline comprend trois carbones saturés dont le dernier est lié à la fonction α-aminée incluse dans la liaison peptidique. Le tout forme un noyau pyrrole (soit quatre atomes de carbone et un atome d’azote). Ce sont les seuls acides aminés qui possèdent une fonction amine secondaire, d’où leur nom plus approprié d’imino-acides (Figure IV. 6). L’hydroxyproline est un constituant spécifique du collagène. Une méthode de dosage de la protéine de collagène est d’ailleurs basée sur cette caractéristique.100 La présence de ces acides aminés dans la structure primaire de la protéine empêche la constitution des liaisons hydrogènes de la structure secondaire.

Ces acides aminés confèrent également à la rigidité de la structure secondaire de la protéine de collagène et permet d’améliorer la stabilité thermique de celle-ci. Les résidus de glycine, positionnés face à face à l’intérieur de la triple hélice favorisent sa compaction. Les résidus de proline et d’hydroxyproline, quant à eux, sont exposés au solvant et stabilisent la conformation de la triple hélice101.

La composition en acides aminés du collagène de type I provenant de l’os et du tendon est donnée au Tableau IV. 1102.

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Figure IV. 6 : Structures chimiques de l’hydroxyproline et de son précurseur

Tableau IV. 1 : Composition en acides aminés du collagène dans l’os et le tendon. Les chiffres sont exprimés en grammes d’azotes pour 100 g d’azote total.

Structure du collagène de type I

La protéine de collagène est composée de deux séquences α1 et d’une séquence α2. Ces séquences peptidiques ont une composition en aminoacides similaire et sont constituées de 1024 résidus. Elles sont enroulées en une triple hélice contenant trois domaines : le domaine contenant le groupement amine terminal de l’hélice NH2), la triple hélice et le domaine contenant le groupement carboxylique (-COOH). Le principal domaine de l’hélice représente 95% de la molécule. La molécule de collagène présente une longueur d’environ 300 nm et un diamètre autour de 1,5 nm.103

En 1951, Pauling et al. ont montré que la molécule est constituée de trois chaînes polypeptidiques enroulées en une hélice et maintenues grâce à des liaisons hydrogène. En 1954, en s’appuyant sur des

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travaux de diffraction, Ramachandran et al. ont avancé que la triple hélice de collagène est constituée de trois chaines polypeptidiques enroulées gauche, indiquant que les liaisons peptidiques sont en conformation trans et que deux liaisons hydrogène sont impliquées dans chaque triplet. Une liaison hydrogène est formée entre le groupement -NH du résidu glycérine et le groupement -CO du résidu de la seconde position du triplet de la séquence peptidique voisine. Une autre liaison est formée entre molécule d’eau et le groupent hydroxyl de l’hydroxyproline située sur la troisième position du triplet [Gly-X-Y]. En 1955, la structure de la triple hélice de collagène a été finalement définie, par Rich et al. et par Cowan et ses collaborateurs.104,105,106 Ils précisent que les chaînes polypeptidiques sont liées par une seule liaison hydrogène à chaque triplet et présentent une symétrie hélicoïdale avec un pas de 28,6 Å. Cette triple hélice de collagène est également caractérisée par un nombre de 3,33 résidus par tour d’hélice et une translation des unités successives de 0,29 nm parallèlement à l’axe de l’hélice (Figure IV. 7). 107

Figure IV. 7 : Modèle de la triple hélice de collagène. Structure de la séquence (Gly-Pro-Pro)n où la glycine est désignée par le numéro 1, la proline en position X-position par le 2 et la proline en Y-position par le chiffre 3. A) et B) correspondent aux vues de côté et C) à la vue de dessus en direction de l’axe de l’hélice. Les trois chaînes sont connectées par des liaisons hydrogène entre le groupement amine de la glycine et le groupement carboxylique de la proline en position Y. Les flèches indiquent les directions dans lesquelles les noyaux pyrroles émergent de l’hélice. Les distances résidu-résidu sont indiquées en nm. Image issue de la référence107.

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Une matière première naturelle

Le collagène de type I est très abondant dans de nombreux tissus et peut être isolé et purifié. Plusieurs chercheurs ont montré que la source de la protéine de collagène influence grandement les propriétés de l’hydrogel.108,109 Par ailleurs, il a été montré que la méthode par laquelle le collagène est extrait des tissus peut altérer ou modifier la structure moléculaire des fibrilles ainsi que la cinétique d’agrégation.110 L’extraction acide est la méthode la plus utilisée pour les matrices de collagène peu réticulées, telles que les tendons de queue de rat. Alors que pour les matrices présentant de nombreux points de réticulation, une méthode combinant une extraction acide et une précipitation saline est souvent utilisée pour solubiliser la matrice provenant du derme d’origine porcine ou bovine. Les sources de collagène, les méthodes de solubilisation et la nature des solvants utilisés sont autant de combinaisons possibles pour la préparation de la solution stock de collagène.

Les tendons de queue de rat représentent la première source de collagène.97,111 La majorité des travaux utilisant du collagène de type I ont été réalisés à une concentration de 2 mg/mL. Cependant, certains gels sont préparés à des concentrations relativement élevées au-dessus de 20 mg/mL. Il a été montré que ces gels présentent une structure trop dense pour permettre la migration des cellules et assurer la viabilité cellulaire.112

Comme toute source naturelle, la composition des solutions stock de collagène présente une variabilité inter-lot. Par conséquent, au cours de ces travaux, nous avons utilisé le même lot de collagène au cours d’une même étude.