Formation d’agrégats lors de la neutralisation de la solution de collagène ?

Comme nous l’avions décrit précédemment, l’agrégation du collagène est sensible aux conditions de température, de pH et de force ionique. Jusqu’ici les solutions sont préparées dans la glace pour ralentir la cinétique d’agrégation du collagène. D’après nos courbes de cinétique, l’agrégation du collagène est inhibée à 4°C. Or les évènements de bouffées observées sur le jet semblent indiquer la formation d’agrégats. Ceci pourrait s’expliquer par le fait que les éventuels agrégats de collagène formés soient de tailles insuffisantes pour être détectés par la spectroscopie ou encore que ces derniers se soient formés au cours du procédé d’encapsulation. En effet malgré toutes les précautions prises pour maintenir l’échantillon à froid (incubation à 4°C des solutions, des cônes de micropipette et du tube d’injection), l’échantillon subit des variations de température notamment lors de son passage à travers l’injecteur. Compte tenu d’une importante surface, les échanges thermiques entre le fluide de cœur et le système d’injection sont inévitables.

0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 10 0,25 % HEC 0,25 % HEC 0,2% collagène 0,2 % collagène



y

(µ

m

)

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Dans cette section, nous souhaitons vérifier si les perturbations observées au sein du jet sont liées à l’agrégation in situ du collagène. Pour cela, nous nous intéressons à l’extrusion de la suspension de collagène préparée dans du tampon phosphate à 4°C sous deux conditions de pH : acide et neutre. Ici, le pH du milieu étant un point de contrôle de l’agrégation du collagène. Dans les deux cas la suspension de collagène est diluée dans du tampon salin phosphate. Nous savons pertinemment qu’à pH acide, le collagène est maintenu en solution. L’écoulement des dispersions de collagène dans du tampon phosphate sera également comparé à celui d’une solution de collagène contenant 20 mM d’acide acétique et à une solution de polyéthylène glycol qui présente une viscosité à cisaillement nul de 10 mPa.s, soit similaire à celle des suspensions de collagène à 20 mM d’acide acétique. Nous nous proposons d’étudier l’effet de l’agrégation du collagène modulée par le pH du milieu sur la dynamique de brisure du jet libre. Ici, la mesure de la longueur de fragmentation nous permet d’évaluer l’amplitude des perturbations qui sont amplifiées via l’instabilité capillaire.

A la Figure IV. 24, en comparant les jets libres des dispersions de collagène à celui du PEG (Figure IV. 24 a), on remarque que la présence de collagène change la dynamique de rupture du jet. En effet, les longueurs de rupture des solutions de collagène sont nettement inférieures à celle du PEG. Et, la longueur de brisure de la suspension de collagène à pH neutre est d’autant plus courte. Par ailleurs, nous observons à l’extrémité du capillaire, des corrugations uniquement au sein du jet de la solution de collagène dans du tampon salin à pH neutre (Figure IV. 24 d).

Figure IV. 24 : Fluides en extrusion simple : (a) PEG20000 à 0.5%m (b) Solution de collagène dans 20 mM acide acétique àpH = 3,5 (c) Solution de collagène dans tampon salin phosphate à pH = 4,5. (d) Solution de collagène dans tampon salin phosphate pH = 7,3. Débit =220 mL.h-1. Diamètre injecteur=200 µm. La barre d’échelle représente 1 mm.

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Nous avons mesuré la longueur de fragmentation de ces jets de fluides en extrusion simple. Les résultats sont reportés à la Figure IV. 25. Nous observons que la taille moyenne du jet de collagène à pH acide est plus faible que celle de la solution de PEG. Elle varie de 9 à 7 mm approximativement. Ainsi, ce résultat confirme que la simple présence de collagène perturbe l’écoulement. Maintenant, si l’on compare les jets des trois solutions contenant du collagène, nous remarquons que la taille du jet contenant une solution de collagène dilué dans du PBS à pH acide est plus faible que celle contenant du collagène dilué dans de l’eau. Enfin, le jet de la solution de collagène dilué dans du PBS à pH neutre est davantage plus court. De ces résultats nous déduisons que, la présence du collagène à l’état d’oligomères perturbe l’écoulement et cette perturbation est d’autant plus amplifiée lorsque le collagène est sous forme d’agrégats. Nous savons que la taille des agrégats de collagène formés à pH neutre dans du PBS peuvent atteindre au moins quelques dizaines de µm. La taille de ces agrégats est alors du même ordre de grandeur que le capillaire de l’injecteur.

Figure IV. 25 : Instabilité capillaire des jets libres. Mesure de la longueur de fragmentation des jets libres de différents fluides. Fluides : PEG, Collagène dans PBS pH acide, Collagène dans PBS pH neutre

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0 2 4 6 8 10 12 PEG

Collagène dans eau, pH acide

Collagène dans PBS, pH acide

Collagène dans PBS, pH neutre

D

ensit

é

d

e

p

ro

b

ab

ilit

é

L

(mm)

141

Cette expérience nous a permis de mettre en évidence la formation d’agrégats de collagène suite à la neutralisation de la suspension de collagène à 4°C, bien que les mesures de spectrophotométrie présentées à la Figure IV. 11 ne montrent aucune variation d’absorbance significatives. Il semblerait alors que la méthode de spectrophotométrie ne soit pas aussi sensible que l’étude de l’écoulement. Ainsi, abaisser la température de travail ne semble pas retarder suffisamment l’agrégation du collagène au cours du procédé. La formation de ces agrégats de collagène déclenchée lors de la neutralisation de la suspension est critique pour l’étape d’extrusion. Par ailleurs pour des raisons de reproductibilité, il n’est pas envisageable d’utiliser une suspension qui évolue continument. L’abaissement de la température de travail ne constitue pas un levier pour stabiliser la suspension. Comme nous l’avions décrit précédemment, l’agrégation est influencée par le pH et la force ionique du milieu. Or maintenir le pH du milieu à un pH physiologique est primordial pour la viabilité des cellules. Etant donné qu’il n’est pas possible de travailler en conditions acides du fait de l’extrusion simultanée de la suspension cellulaire, il nous faut envisager d’autres alternatives compatibles avec la culture des cellules et qui limitent l’agrégation du collagène avant l’encapsulation.