Méthodologie

La résine, les acides aminés Fmoc et les réactifs de couplage ont été achetés chez Matrix Innovation (Québec, QC). Les différents solvants, acides et bases proviennent de chez Sigma-Aldrich (Oakville, ON) ou Fisher Scientific (Ottawa, ON).

2.2.1 Couplage du premier acide aminé

La résine est d’abord pesée (0,350 g) puis transférée dans la seringue. Différentes résines de Wang sont disponibles dépendamment du taux de substitution visé. Ici, comme le peptide à synthétiser est relativement long, nous avons choisi une résine avec un taux plutôt bas, soit 0,46 mmol/g, afin de minimiser l’encombrement stérique entre les chaînes peptidiques et ainsi favoriser les couplages. Avec 350 mg de résine, on peut donc fixer 0,161 mmol de Fmoc-Met. La solution d’activateurs et d’agents de couplages25 _(voir

Tableau 2.1) est préparée dans un ballon, sur bain de glace. L’acide aminé est en excès à 3 équivalents (éq.),

soit ici 0,483 mmol. Les produits sont ensuite dissouts dans environ 10 mL de diméthylformamide (DMF).

Produits Nombre d’éq. Fmoc-Met 3 HOBt 3 DIC 3 DMAP 0,1 DIEA 4

Tableau 2.1 : Solution d’activation pour le couplage de la Fmoc-Met sur la résine de Wang.

La résine est d’abord gonflée avec du dichlorométhane (DCM) puis la solution d’activation est ensuite insérée. La seringue est placée sur une plaque agitatrice pendant 3 heures. Après avoir évacué la solution d’activation, la résine est lavée. À chaque fois qu’il sera question de lavage, le procédé est toujours le même : on rince avec environ 10 mL de DMF, trois fois, puis avec la même quantité de méthanol (MeOH), trois fois, puis encore au DMF (3x) et encore au MeOH (3x). La résine est finalement séchée sur rampe à vide.

Le taux de substitution est évalué par spectrométrie UV-vis en dosant le dibenzofulvène (DBF) relargué par un échantillon de résine substituée traitée par la base 1,8-diazobicycloundec-7-ène (DBU).26 _{Un taux de}

substitution de 0,21 mmol/g a été mesuré, signifiant que moins de la moitié des sites disponibles de la résine ont réagi. La réaction a été lancée une seconde fois, sur la résine déjà substituée, dans les mêmes conditions.

19 Un taux final de 0,30 mmol/g a été mesuré et jugé satisfaisant. Les sites restant sont inactivés par acétylation. La seringue est remplie d’une solution d’anhydride acétique est de DMF en ratio 1 : 1 avec 10 % de N,N’- diisopropyléthylamine (DIEA) et agitée pendant 1 heure. La résine est lavée, puis séchée.

2.2.2 Couplage des acides aminés suivants

Les vingt acides aminés suivants ont tous été couplés de la même manière. D’abord, environ 10 mL de solution de déprotection sont aspirés dans la seringue. Cette solution consiste en un mélange de pipéridine et de DMF dans un ratio 1:4. La seringue est agitée pendant 10 minutes après quoi la solution est évacuée. Cette étape est répétée une seconde fois. Finalement, la résine est lavée, en finissant ici avec le DMF.

On prépare la solution de couplage dans un vial, soit 3 éq. d’hyrdroxybenzotriazole (HOBt), 3 éq. de O- (benzotriazol-1-yl)- tetraméthyluronium hexafluorophosphate (HBTU) et 3 éq. de l’acide aminé désiré. Le tout est dissout dans environ 10 ml de DMF et 3 éq. de DIEA sont ajoutés juste avant l’insertion dans la seringue. Le tout est agité une heure, la résine est finalement lavée, puis séchée.

Afin de s’assurer du bon fonctionnement du couplage, on effectue le test de Kaiser sur quelques grains de résine.27 _{Ce test qualitatif utilise la ninhydrine, qui réagit avec les amines libres en induisant une coloration}

violet intense. Si aucune coloration n’est observée, on commence le couplage suivant, et ainsi de suite jusqu’à l’obtention du peptide final.

Figure 2.1 : Schéma réactionnel des étapes de couplages de la synthèse peptidique. La résine est

2.2.3 Clivage et récupération du peptide

Avant de cliver le peptide de la résine, le dernier groupe protecteur est retiré. Le clivage ce fait en milieu acide, dans une solution d’acide trifluoroacétique (TFA) concentré en présence de triisopropylsilane (TIS). On prépare environ 10 mL de TFA : H2O : TIS dans un ratio 95 : 2,5 : 2,5. La solution est aspirée dans la

seringue, qui est agitée pendant 3 heures. La solution de clivage contenant le peptide déprotégé est récupérée dans un ballon et la résine est rincée quelques fois au DCM. Le peptide est précipité par l’ajout de quelques millilitres d’éther et le ballon est placé sur l’évaporateur rotatif. Cette étape est répétée cinq fois en tout. Finalement, le peptide est dissout dans un minimum d’eau distillée et est lyophilisé.

Le peptide récupéré a été caractérisé par spectrométrie de masse sur un chromatographe liquide LC1200 couplé à un spectromètre de masse MS-TOF 6210 (Agilent Technology, Santa Clara, CA). On retrouve sur le spectre à la Figure 2.2a, en plus du pic de la thanatine (masse attendue 2434,29 m/z, pic [M + 3H]3+ _{à 812,10}

m/z), un pic assez intense (32 % du pic de Th) avec exactement la masse d’un atome d’oxygène en trop (pic [M + O + 3H]3+ à 817,77 m/z). Effectivement, la méthionine est sensible à l’oxydation et peut être oxydée en Met-sulfone ou, dans ce cas-ci, en Met-sulfoxyde (Met(O)). Nous avons tenté une réduction par l’iodure d’ammonium en milieu acide selon une méthode publiée28 _{mais nous n’avons pas été en mesure de récupérer}

le produit. Nous n’avons eu d’autre choix que de refaire la synthèse au complet. Afin d’empêcher l’oxydation de la 21-Met, de l’éthanedithiol (EDT) est ajouté à la solution de clivage, qui est maintenant TFA : H2O : EDT :

TIS dans un ratio 94 : 2,5 : 2,5 : 1. Le spectre de masse montre encore quelques traces du signal de la thanatine oxydée, mais ce dernier a presque complètement disparu (voir Figure 2.2b). Ce résultat a été considéré comme satisfaisant et ce produit a été utilisé pour la suite de ce travail.

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Figure 2.2 : Spectres de masse de la thanatine. a) Première synthèse. b) Deuxième synthèse, avec EDT.

2.2.4 Formation du pont disulfure

La dernière étape avant l’obtention du peptide final consiste à former le pont disulfure entre la 11-Cys et la 18- Cys par oxydation en milieu basique. Le peptide est dissout dans une solution de carbonate d’ammonium 0,1 M. On fait ensuite tranquillement buller de l’air dans la solution. Après 3 heures, un spectre de masse nous confirme le départ de deux protons, signe que l’oxydation a réussie. Aucun pic ne semble indiquer la présence de ponts intermoléculaires.

2.2.6 Spectroscopie infrarouge

Ici, la spectroscopie IRTF est utilisée afin d’observer la présence de sels de TFA résiduels. En effet, une bande intense centrée à 1672 cm-1 _{est associée à l’élongation du carbonyle du trifluoroacétate.}29 _{Ces sels sont}

retirés par plusieurs cycles de dilutions dans l’eau distillée puis lyophilisation. Après cinq cycles, un second spectre IR a été enregistré et la bande a effectivement disparue. On voit que, sur la Figure 2.3, la courbe en bleu ne présente plus que la bande amide I’ du peptide, qui nous informera sur la structure secondaire du peptide.

Figure 2.3 : Région de la bande amide I’ du spectre IR de la thanatine avant et après la purification par cycles

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