Diffusion dynamique de la lumière

La diffusion dynamique de la lumière, ou dynamic light scattering (DLS), est une technique très utile qui permet de mesurer la taille de particules sphériques en suspension dans un solvant, de l’échelle du nanomètre à quelques micromètres. Nous étudierons ici des vésicules unilamellaires de taille unique, obtenues par un procédé d’extrusion qui sera détaillé plus loin. Dans les cas où la thanatine devait causer l’agrégation des vésicules, une augmentation importante de la taille moyenne des particules en suspension serait observée.

Le principe à l’origine de la DLS est relativement simple. Un laser polarisé est dirigé vers une cuvette contenant la suspension étudiée. Bien que la majorité de la lumière incidente traverse l’échantillon, une fraction de celle-ci est diffusée par des collisions élastiques avec les particules. Selon la théorie de la diffusion de Rayleigh, si les particules sont petites par rapport à la longueur d’onde du laser, alors la diffusion sera équivalente dans toutes les directions. Le détecteur est donc placé non pas en ligne avec le laser, mais à un certain angle afin de ne mesurer que la lumière diffusée, tel qu’indiqué à la Figure 4.1.

Figure 4.1 : Schématisation d’un appareil DLS. a) Source laser. b) Échantillon. c) Détecteur. d)

Corrélateur/ordinateur. (→) Lumière incidente. (– – →) Lumière diffusée.

À chaque instant, une certaine intensité I frappe le détecteur. Cependant, comme les particules sont en mouvement, I fluctue à travers le temps. Sans apport extérieur, les déplacements des particules dans le solvant sont dictés par le mouvement brownien et à conditions constantes, leur vitesse n’est influencée que

par leur taille. Notons ici que la sphère d’hydratation qui entoure les particules dans un solvant aqueux affecte ces mouvements, la taille mesurée n’est donc pas la taille absolue mais inclut le rayon hydrodynamique. Il existe donc une relation entre la vitesse des fluctuations de I dans le temps et la taille des particules, qui est mise en graphique à la Figure 4.2. Les particules plus grosses, se déplaçant plus lentement, entraînent des fluctuations plus espacées dans le temps.

Figure 4.2 : Fluctuation de l’intensité lumineuse détectée. a) Grosses particules. b) Petites particules.

Ces fluctuations sont enregistrées par le logiciel qui ensuite évalue l’autocorrélation du signal, en comparant la valeur de I à un temps t donné avec celle à t+Δt, t+2Δt, t+3Δt et ainsi de suite. Évidemment, comme toutes les particules sont animées par des mouvements aléatoires, la corrélation diminue avec le temps, comme le montre la Figure 4.3. Cependant, elle sera plus vite perdue pour un système contenant de plus petites particules. C’est à partir de ces fonctions d’autocorrélation que l’appareil évalue la taille des particules en suspension.

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Figure 4.3 : Diminution de l’autocorrélation du signal en fonction du temps.

Toujours selon la théorie de la diffusion de Rayleigh, l’intensité de la lumière diffusée est proportionnelle au diamètre des particules selon :

Ceci implique qu’une particule d’un diamètre de 100 nm va diffuser un million de fois plus de lumière qu’une particule de 10 nm de diamètre (Figure 4.4). Bien que cette relation puisse être limitante lorsque vient le temps d’observer différentes populations de particules de tailles variables, elle nous permettra ici de détecter facilement la moindre formation d’agrégats.

Figure 4.4 : Comparaison entre le nombre de particules de tailles différentes et l’intensité lumineuse qu’elles

4.1.1 Méthodologie

À la différence des expériences décrites au chapitre précédant, les bicouches lipidiques modèles seront ici sous la forme de vésicules unilamellaires de taille constante. La méthode utilisée au laboratoire pour obtenir de telles vésicules est la technique d’extrusion. Dans le contexte de ce travail, elle consiste en le passage forcé et répétitif d’une suspension de phospholipides hydratés à travers une membrane de polycarbonate poreuse dont la grosseur des pores est unique et connue. Les vésicules ainsi obtenues auront dans notre cas un diamètre d’environ 100 nm et sont généralement connues sous le nom de larges vésicules unilamellaires (large unilamellar vesicles, LUV).45

Afin de préparer les LUV, une quantité adéquate de lipides en solution dans CH2Cl2/MeOH sont placés dans

un vial, mélangés s’il y a lieu selon le modèle produit. La majeure partie du solvant est évaporée sous jet d’azote et les échantillons sont lyophilisés pour la nuit et conservés au congélateur. Le jour de l’analyse, les lipides sont hydratés avec le tampon HEPES 10 mM/EDTA 0,5 mM afin d’obtenir une concentration totale de lipides de 20 mM. Cette suspension est agitée avec un barreau magnétique pendant une heure. L’échantillon est ensuite prélevé dans une seringue adaptée à un montage Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids) présenté à la

Figure 4.5a. Les deux seringues, l’une contenant la suspension lipidique et l’autre vide, sont séparées par une

membrane de polycarbonate avec des pores de 100 nm de diamètre (Whatman) coincée entre deux supports de téflon, tel que montré à la Figure 4.5b. La solution est poussée à travers la membrane par l’action des seringues. En tout, 21 passages sont faits. Le nombre impair de passages nous assure qu’aucune grosse impureté solide ne se retrouve dans la solution finale.

Pour les mesures de DLS, la solution est de nouveau diluée dans le même tampon afin d’obtenir une concentration finale de lipides de 0,1 mg/mL en considérant que la concentration initiale n’ait pas changée pendant l’extrusion. Cette solution est finalement divisée en parties aliquotes de 1 mL dans les cuvettes en acrylique jetables.

Pour les échantillons qui contiennent de la thanatine, cette dernière est ajoutée par l’entremise d’une solution de 10 mg/mL dans le tampon HEPES afin d’obtenir une concentration finale dans l’échantillon de thanatine de 100 µM.

Les mesures sont enregistrées à l’aide d’un appareil Zetasizer Nano ZS (Malvern) muni d’une source laser He-Ne de 4 mW à longueur d’onde de 633 nm. La lumière diffusée est détectée à un angle de 173º du rayon incident par une photodiode à avalanche. Chaque résultat présenté est la moyenne de deux réplicas, mesurés chacun trois fois. Les incertitudes sont calculées par l’écart type à la moyenne. Les résultats sont enregistrés à une température de 37 ºC, avec une période de stabilisation de la température de 300 secondes.

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Figure 4.5 : Montage Mini-Extruder pour l’extrusion de larges vésicules unilamellaires (LUV).

4.1.3 Résultats

Le modèle procaryote du premier système a été le premier à être étudié par DLS dans le but de confirmer que ce modèle n’interagissait pas beaucoup avec le peptide, tel que vu au Chapitre 3. Les mesures, présentées en pourcentage d’intensité en fonction du diamètre en nm, sont à la Figure 4.6. La courbe en rouge correspond aux LUV de DMPG seules. La distribution gaussienne, centrée au diamètre moyen de 111 nm vient confirmer le bon fonctionnement de l’extrusion dans les conditions choisies. La courbe en bleu nous montre la même solution de vésicules, 30 minutes après l’ajout de 100 µM de thanatine. Une petite contribution au signal est visible entre 5000 et 6000 nm, mais le diamètre moyen, à 119 nm, reste quasiment

inchangé. Ce résultat n’est pas en accord avec les observations in vivo qui décrivent une agrégation bactérienne intense et immédiate.9 _{Le premier système modèle a donc été jugé inapte à recréer l’activité}

antimicrobienne de la thanatine et a été mis de côté.

Figure 4.6 : Mesures DLS de LUV du modèle procaryote du premier système seules ou en présence de

thanatine (100 µM).

Les expériences DLS ont été les premières analyses conduites sur le second système de modèles. Les mesures de contrôle, sans thanatine, ont montré que la méthode de préparation des LUV était fonctionnelle pour tous les mélanges lipidiques. La Figure 4.7 montre les différents résultats pour chacun des modèles. L’effet de la thanatine a été enregistré 30 minutes après l’ajout (lignes pleines), puis une seconde fois après 4 heures (lignes pointillées). Dans tous les cas, les mesures de contrôle ont montré que les vésicules seules sont stables, c’est-à-dire qu’aucune agrégation ou augmentation anormale de la taille n’était observée.

Remarquons d’abord que le modèle eucaryote reste pratiquement inchangé par le peptide, et ce même après 4 heures. Comme la thanatine est naturellement sélective, il est impératif que le système de modèles utilisé puisse représenter cette sélectivité afin de pouvoir obtenir des résultats pertinents. Chez les modèles G- et G+, une grande population de particules de grandes tailles apparaît suite à l’ajout de la thanatine, déjà après 30 minutes. En fait, l’augmentation de la turbidité était instantanée et visible à l’œil nu.

Il est important de savoir que la DLS n’est pas apte à différencier avec précision de nombreuses populations de particules de tailles extrêmement variables. Ici, l’agrégation est rapide et incontrôlée. Certains agrégats sont de tailles macroscopiques et une vaste gamme de tailles d’agrégats est probablement présente. La position des bandes est plutôt à titre indicatif, révélant simplement la présence d’agrégation. C’est pourquoi ces résultats ainsi que les suivants seront plutôt comparés par leur valeur de diamètre moyen, fournis par le logiciel.

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Figure 4.7 : Mesures DLS de LUV du second système de modèles seules ou en présence de thanatine après

Comme il est clair que ce nouveau système de modèles répond de manière sélective à l’agrégation induite par la thanatine, nous avons voulu savoir si cet effet serait affecté par la force ionique de la même manière que l’activité antibiotique de la thanatine. Tel que mentionné à la Section 1.3.3, la présence de cations mono- ou bivalents diminue l’activité de la thanatine. L’expérience a donc été répétée dans les mêmes conditions, à la différence que le tampon HEPES contenait en plus 150 mM de NaCl. Ces résultats ainsi que les précédents sont présentés à la Figure 4.8.

Bien que dans certains cas, principalement pour le modèle G-, la présence de sel semble affecter la taille des LUV des solutions de contrôle, celles-ci sont tout aussi stables dans le temps et leur taille reste beaucoup plus petite que s’il y avait agrégation. Les effets observés sont donc entièrement causés par la présence du peptide. Le modèle Eu, avec ou sans sel, reste inchangé par l’ajout du peptide. Pour le modèle G-, il est très intéressant de voir que la présence de NaCl fait diminuer la taille moyenne des agrégats de plus de moitié. Le même résultat est obtenu avec le modèle G+ si quatre heures sont laissées à l’échantillon pour se stabiliser. Les raisons possibles pour expliquer ce phénomène seront étudiées à la Section 4.3, Discussion.

Sans nous informer spécifiquement sur le mode d’action de la thanatine, ces résultats nous montrent qu’il y a bel et bien interaction entre le peptide est les phospholipides anioniques retrouvés dans les membranes bactériennes. Les LUV de phospholipides agrègent comme les bactéries en présence de thanatine, ce qui n’avait pas encore été confirmé par des expériences biophysiques.

En menant les expériences DLS, il a été observé que l’activité débutait très rapidement suite à l’ajout du peptide. Bien que la taille des agrégats mesurée offre des résultats intéressants, connaître la cinétique de l’agrégation est très utile pour compléter notre analyse. Cependant, comme chaque mesure de DLS prend plus d’une dizaine de minutes, et ceci en plus de la période de stabilisation de la température, cette technique n’est pas adaptée pour nous fournir de l’information sur la cinétique. Nous nous sommes donc tournés vers la spectrométrie UV-vis et avons développé une méthode de mesure de la turbidité qui est présentée à la section suivante.

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Figure 4.8 : Diamètres moyens des LUV du second système de modèles et des agrégats engendrés par

l’addition de 100 µM de thanatine en fonction du temps et en présence de sel ou non. a) Modèle eucaryote. b) Modèle G-. c) Modèle G+.

4.2 Spectrométrie UV-visible

En spectrométrie UV-vis, l’intensité lumineuse d’un faisceau traversant un échantillon est comparée à l’intensité initiale afin de mesurer l’absorbance, et ce, aux différentes longueurs d’onde de la plage UV-vis, soit environ entre 200 et 800 nm. Contrairement à la spectroscopie IR avec laquelle on observe des moments de transition vibrationnels, l’énergie plus élevée de la lumière UV-vis correspond plutôt à des transitions entre des niveaux électroniques. C’est pourquoi cette méthode est souvent utilisée pour caractériser des chromophores.

Ce n’est toutefois pas le cas ici, les molécules et structures étudiées étant incolores. Dans le cadre de ce travail, c’est plutôt la turbidité de l’échantillon qui sera évaluée.46 _{Lors des études en DLS, il était clair que}

l’agrégation faisait augmenter la densité optique des solutions de LUV. Les échantillons, complètement transparents au départ, devenaient rapidement de couleur blanchâtre, semi-opaque. On utilise donc le spectromètre à une longueur d’onde à laquelle aucune transition électronique n’est associée afin de seulement observer l’augmentation de l’opacité, ou turbidité, engendrée par l’agrégation. La cinétique du phénomène sera simplement rapportée en unités d’absorbance en fonction du temps.

4.2.1 Méthodologie

Les phospholipides du second système de modèles sont hydratés, extrudés puis dilués de la même manière que pour les expériences en DLS. Le volume des échantillons ici est de 2 mL et la thanatine est ajoutée sous la forme d’une solution de 5 mg/mL dans le tampon HEPES (voir Section 4.1.2).

L’absorbance est mesurée par un spectrophotomètre Cary 500 (Varian) à double faisceau muni d’une lampe au tungstène et d’un détecteur à tube photomultiplicateur. La longueur d’onde est fixée à 450 nm. Un balayage rapide nous a confirmé que cette région spectrale ne présente aucune bande d’absorbance due à une transition électronique. L’appareil n’étant pas muni d’un contrôleur de température, les mesures ont été enregistrées à la température de la pièce, soit aux alentours de 20 ºC.

Les mesures s’étalent sur une période de 20 minutes. L’absorbance est mesurée aux 15 secondes entre 0 et 3 minutes, aux 30 secondes entre 3 min 30 s et 5 minutes, à toutes les minutes entre 6 et 10 minutes, puis aux 2 minutes pour un total de 20 minutes. Lors des étapes d’optimisation, il a été observé que la qualité des résultats dépendait beaucoup de l’homogénéité des échantillons, c’est pourquoi la cuvette est légèrement agitée en la retournant entre chaque acquisition. Les expériences ont toutes été dupliquées. Les incertitudes sont calculées par l’écart type à la moyenne.

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4.2.3 Résultats

Les courbes de cinétique d’agrégation des différents modèles sont présentées à la Figure 4.9. Dans le cas des LUV du modèle eucaryote, il avait été observé par DLS qu’aucune agrégation ne semblait avoir lieu à une concentration de thanatine de 100 µM. La concentration de peptide a donc été augmentée, jusqu’à un maximum de 500 µM, ce qui est énormément plus concentré que dans l’hémolymphe de l’insecte. Seulement une très légère augmentation de l’absorbance est observée, même à cette concentration, confirmant de nouveau la validité du modèle.

On remarque ici que les modèles G- et G+, bien que présentant tous deux des signes évidents d’agrégation, n’adoptent pas le même comportement. À 10, 20 et 50 µM de thanatine, l’absorbance des solutions de LUV du modèle G- augmente continuellement jusqu’à atteindre un maximum après un peu plus 3 minutes. Ensuite, l’absorbance diminue, lentement et graduellement. À 5 µM, l’absorbance reste plus longtemps à sa valeur maximale avant de décroître aussi, plus lentement.

Un comportement similaire, soit une ascension rapide de l’absorbance suivie d’un déclin graduel, est observé avec les LUV du modèle G+, mais seulement en présence de 50 µM de thanatine. À plus faibles concentrations du peptide, l’absorbance maximale est atteinte très rapidement, soit en moins de 30 secondes, puis cette valeurs plateau est mesurée jusqu’à la fin de l’expérience.

Afin de mieux comprendre pourquoi dans plusieurs cas l’absorbance diminue après avoir atteint une valeur maximale, on peut se référer à l’aspect macroscopique des solutions. On peut déjà écarter le fait que les agrégats sédimentent car les échantillons sont agités avant chaque mesure. À la Figure 4.10, on compare l’aspect visuel des solutions dans la cuvette à différents moments de l’expérience de cinétique. Au point 1, soit à t = 0, l’absorbance est minimale et la solution est complètement translucide. Lorsque l’absorbance atteint sa valeur maximale, au point 2, la solution n’est plus claire mais plutôt blanchâtre et ce, de manière homogène. Toutefois l’agrégation ne s’arrête pas pour autant. En fait, les agrégats continuent de s’agglomérer jusqu’à être de tailles macroscopiques. La solution est alors comparable à la cuvette 3, soit une solution hétérogène dans laquelle flottent de gros agrégats. Ceci a pour effet de faire diminuer l’absorbance mesurée malgré le fait que l’agrégation continue d’évoluer. En ce qui concerne les résultats du modèle G+ à basse concentration de thanatine, les solutions étaient effectivement comparables à la cuvette 2, soit d’opacité homogène, tout au long de l’expérience.

Figure 4.9 : Courbes de cinétiques d’agrégation des LUV du second système de modèles à différentes

concentration de thanatine. Les barres d’erreurs représentent l’écart-type sur deux réplicas. a) Modèle eucaryote. b) Modèle G-. c) Modèle G+.

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Figure 4.10 : Comparaison entre a) la position sur la courbe de cinétique d’agrégation et b) l’aspect

macroscopique de la solution, ici pour le modèle G- en présence de 10 µM de thanatine.

L’effet de la force ionique a aussi été observé avec les LUV du modèle G-. La cinétique d’agrégation a été mesurée en présence de 10 µM de thanatine et ce, avec ou sans 150 mM de NaCl dans la solution. On peut voir les deux courbes à la Figure 4.11. En présence de sel, l’absorbance reste constante à la valeur maximale tout au long de l’expérience, de la même manière que le modèle G+ à basse concentration de thanatine décrit plus haut. L’aspect macroscopique de la solution était aussi comparable à la cuvette 2 de la Figure 4.10b. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus par DLS. La présence de sel limite la croissance des agrégats.

Figure 4.11 : Courbes de cinétique d’agrégation des LUV du modèle G- en présence de 10 µM de thanatine à

différentes concentrations de NaCl. . Les barres d’erreurs représentent l’écart-type sur deux réplicas.

4.3 Discussion

L’objectif principal de ce chapitre était de savoir s’il était possible de recréer avec nos modèles le phénomène d’agrégation bactérienne engendré par la thanatine. Nous avons démontré que le second système de modèles réagissait de manière sélective à l’agrégation et qu’il était affecté par la force ionique de la même manière que celle détaillé dans la littérature.

D’abord, les expériences conduites par DLS ont confirmé le bon fonctionnement de la méthode de synthèse de LUV de tailles communes pour chaque modèle, avec ou sans NaCl. La sélectivité de la thanatine envers les membranes bactérienne a aussi été mimée, l’agrégation n’étant visible que chez les modèles G- et G+. Finalement, l’ajout de NaCl semble inhiber partiellement l’activité de la thanatine, ce qui concorde avec les résultats in vivo de la littérature.

Les mesures de turbidité en fonction du temps par spectrométrie UV-vis nous ont permis de caractériser l’aspect dynamique de l’agrégation. En combinant les résultats des deux méthodes d’analyse et en incluant l’aspect visuel des solutions, on obtient un aperçu assez complet de ce qui se passe dans la cuvette suite à l’addition de thanatine. Chez le modèle G-, l’agrégation augmente exponentiellement et la taille des agrégats continue d’augmenter jusqu’à ce que ces derniers aient l’aspect de flocons en suspension. Il est intéressant de constater que la technique est encore sensible à une concentration de thanatine de 5 µM, soit pratiquement aussi basse que la concentration endogène. Chez le modèle G+, si la thanatine est à une concentration

65 minimale de 50 µM, le comportement est le même que chez G-. Si la concentration est plus basse, ici 20 µM et moins, la taille des particules augmente très rapidement, puis se stabilise à taille intermédiaire et conserve une dispersion homogène dans la solution. Il est possible que la densité de charges à la surface des vésicules y soit pour quelque chose. En effet, la totalité des lipides du modèle G+ sont porteurs d’une charge négative