Méthodologie du projet

1.6.1. Production de la souris Entpd8

Des cellules souches embryonnaires de souris déficientes pour le gène complet codant pour la NTPDase8 fournies par le service KOMP de l’université de Californie, ont été injectées dans des blastocystes de souris B6(Cg)-Tyrc-2j/J par la plateforme de transgénèse de l’Institut de Recherche en Immunologie et Cancérologie de Montréal. Les chimères obtenues ont été rétro-croisées dans notre laboratoire pendant 7 générations avec des souris C57/BL6 en sélectionnant les souris

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Lignée de souris Entpd8

Extraction d’ADN de souris 129/Sv Amplification par PCR

Isolation du gène de la NTPDase8

Construction du vecteur d’insertion par clonage

Électroporation des cellules ES (recombinaison homologue)

Sélection des clones (PCR et Southern Blot)

Neo

Blastocyste(s) Entpd8+/-

Injection dans le blastomère et ré-implantation à une souris porteuse

Neo

Tk

Figure 9: Design des blastocystes Entp8+/-

1.6.2. Production d’anticorps anti-NTPDase8

Les anticorps polyclonaux contre la NTPDase8 de souris ont été obtenus en immunisant des cochons d’Inde à l’aide d’un vecteur d’expression encodant le gène d’intérêt. Les animaux ont été injectés par voie intra-dermique et intra-musculaire aux semaines 0, 2, 4, 12 et 20 avec 200 µg de plasmide. Le sang a été prélevé 2 semaines après les injections à partir de la troisième injection.

1.6.3. Transfection et préparation des protéines recombinantes

Les cellules COS-7 ont été transfectées avec les plasmides d’intérêt par la méthode utilisant la lipofectamine. Après 3 lavages avec du tampon tris-saline à 4°C, les cellules ont été suspendues dans un tampon 95 mM NaCl, 0.1 mM PMSF, 45 mM Tris, pH 7.5 puis centrifugées 2 fois à 300 g pendant 10 minutes à 4°C. Le culot a ensuite été resuspendu dans le même tampon additionné de 10 µg/ml d’aprotinine, soniqué puis centrifugé de nouveau (3000 RPM pendant 5 min à 4°C). Le surnageant qui contenait les protéines recombinantes a été conservé à -80°C.

1.6.4. Western blot, ELISA et PCR

L’électrophorèse des protéines du foie total a été faite sur SDS-PAGE en conditions non réductrice et le transfert sur une membrane d’Immunoblon-P. Après incubation avec le premier anticorps, la visualisation s’est réalisée grâce au second anticorps couplé à la peroxydase de Raifort (HRP) et à un réactif chimiluminescent.

L’apoptose des hépatocytes [206] et des macrophages [207] étant à la base de la production des médiateurs de fibrogènese [208], nous avons dosé la cytokine TGFβ (tissulaire) qui se trouve être

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le médiateur principal de la fibrogenese, par ELISA. Pour ce faire, le foie a été homogeneisé suivi d’une étape d’activation acide (HCl 1N) et de neutralisation (1,2N NaOH/0,5M HEPES) du TGFβ latent conformément aux spécifications du fabricant du Kit. Les échantillons de dilution 1/100 dans du PBS 1X ainsi que les standards ont été analysés en triplicata. La densité optique de chaque puit a été determinée à 450nm de longueur d’onde grace à un lecteur de plaque.

Les PCR réalisées dans mon projet l’ont été en utilisant 50 à 100 mg de tissu (Pavillon de l’oreille ou Foie) collecté dans une solution de RNA later. En effet pour le genotypage, 50 ng d’ADN génomique extrait de l’oreille des souris a été amplifié par PCR avec la Taq Polymérase et des

amorces spécifiques à la NTPDase8 (F: TGT AAGGGCCAGAAGGATTG; R:

GTACAGACCCGAGGCACAGT) ou celles de la néomycine (F: TCATTCTCAGTATTGTTTTGCC; R: CAGGCATCTAGGATCTGCTC) en 34 cycles de PCR. Pour la RT-PCR, l’extraction de l’ARN total du tissu hépatique a été faite par la méthode utilisant le Trizol. 1 µg d’ARN a servi à la synthèse du cDNA en utilisant le Superscript IIIRT. L’amplification de 1 µl de solution de cDNA a eu lieu dans un volume final de 25 µl de solution contenant 10 pMol de chaque amorce de la NTPDase8 en 28 cycles de PCR . La séparation du produit faite sur gel d’agarose et la visualisation par la technique du Redsafe.

1.6.5. Immunohistochimie et activité enzymatique in situ

Pour l’immunohistochimie, le foie fraichement collecté a été recouvert de gel OCT (Optimum Cutting Temperature), rapidement congelé par immersion dans l’isopentane froid et conservé à -80°C. Des cryosections de 6 µm ont ensuite été étalées sur lame, fixées par le mélange formaline 10%-acétone froid, puis incubées avec les anticorps spécifiques de détection. La rate et le colon ont été utilisés comme tissus contrôles selon les cas.

La prolifération constitue un mécanisme de survie du foie notamment dans les cholestases

obstructives [194] et dans les hépatites. Elle a été évaluée par marquage du Ki67 qui est une protéine présente uniquement dans les noyaux de cellules en cycle cellulaire et ce, quelque soit la phase.

L’infiltration leucocytaire a été focalisée sur les macrophages qui sont et constituent une source

première de TGFβ essentiel à la tranformation des cellules étoilées et à la fibrogenèse hépatique, par marquage au F4/80.

Le contenu en myofibroblastes qui sont des cellules étoilées transformées par l’activation, a été

mise au point par le marquage de l’actine de muscles lisses (α-SMA) qu’elles expriment.

La localisation de l’activité enzymatique in situ a été fait selon la méthode de Braun et al. [209]. Les

cryosections ont été à cet effet, incubées avec les divers nucléotides comme substrats en présence du

lévamisole pour inhiber l’activité de la phosphatase alkaline tissulaire.

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1.6.6. Fibrose hépatique

1.6.6.1. Fibrose hépatique non biliaire

Pour induire la fibrose non biliaire, les souris mâles de 2 à 3 mois ont été injectées avec 2 ml/kg de CCl4 (15% v/v dans l’huile minérale) deux fois par semaine en intra-péritonéal tandis que

les souris contrôles ne recevaient que de l’huile minérale. Les tissus ont été prélevés 4 semaines plutard pour analyse (Figure 10).

Figure 10: Modèle expérimental d’intoxication des souris au CCl4

La lésion hépatique a été évaluée par les colorations Hématoxyline-Éosine, Trichrome-Masson, et Sirius Red sur des cryosections de 6µm de tissu préalablement fixé à la formaline 10%-PBS1X puis enrobé dans la paraffine.

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1.6.6.2. Fibrose hépatique biliaire

Pour induire la fibrose biliaire, une laparotomie a été effectuée sous anesthésie à l'isoflurane selon les principes opératoires standards. Après rasage et désinfection de la paroi abdominale sous-xiphoïdienne, une incision médiane a été effectuée sur la parois abdominale antérieure. Les lobes du foie ont été délicatement écartés pour exposer les voies biliaires [210]. Le canal cholédoque a été isolé et ligaturé à l'aide de deux fils de suture (Figure 11). Les souris contrôles ont aussi été opérées mais sans ligaturer le cholédoque (SHAM). L'incision abdominale a été suturée en deux plans à la fin du modèle. Les souris furent sacrifiées à 2 semaines post- opératoire pour le prélèvement et analyse tissulaire, conformément au schéma évolutif de la fibrose dans l’espèce [211].

Figure 11: Modèle expérimental de ligature du canal biliaire commun des souris

La lésion hépatique a été évaluée par les colorations Hématoxyline-Éosine, Trichrome-Masson, et Sirius Red sur des cryosections de 6 µm de tissu préalablement fixé à la formaline 10%-PBS1X puis enrobé dans la paraffine.

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