Chapître 2. Résultats
2.3. Discussion
Jusqu’à ce jour, il a été rapporté que la NTPDase8 est responsable de la majeure partie de l’hydrolyse des nucléotides extracellulaires dans le foie de rat [215]. L’enzyme a été découverte par notre laboratoire qui l’a ensuite cloné et caractérisé biochimiquement. Cependant, les outils pouvant permettre l’étude de l’impact de cette enzyme in vivo viennent à peine d’être mis au point avec ce travail.
La souris Entpd8-/- obtenue à la suite du processus de délétion et rétrocroisement est
viable. De même, l’anticorps polyclonal généré par immunisation des animaux, reconnait en western blot sur les cellules COS7 transfectées et sur un homogénat de foie de souris sauvage, spécifiquement la protéine de 75 kD qui correspond à notre enzyme (Figure 13A). Le marquage de la protéine par le même anticorps en immunohistochimie sur une cryosection de foie de souris
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sauvage et l’absence de ce marquage chez la souris déficiente confirme à la fois le succès de la délétion ainsi que la spécificité de l’anticorps que nous avons généré (Figure 13B).
La fibrose hépatique constitue la complication commune des hépatites chroniques. Elle implique un dépôt des protéines de la matrice extracellulaire (fibres collagènes, élastiques…), une activation de cellules capables de secréter des médiateurs inflammatoires (cytokines, nucléotides…) et un remodelage tissulaire. Nous avons montré que la ligature biliaire et l’intoxication des souris au CCl4 induisent une inflammation et une fibrose hépatique précoce à
tendance différentielle selon que la souris soit sauvage ou Entpd8-/-, à 2 et 4 semaines comme le
témoignent les zones de nécrose, la présence des cellules littorales et fibreuses ainsi que les foyers inflammatoires.
Les colorations Hématoxyline & Éosine, Sirius red et Trichrome-Masson, pour évaluer l’architecture générale du tissue pour la première et la distribution de la fibrose pour les autres, nous permettent d’affirmer que les souris Entpd8-/- sont à la base plus inflamées et fibrotiques comparativement aux souris sauvages. Parallèlement, ces souris présentent moins d’atteintes aussi bien après le modèle chimique que mécanique d’induction de fibrose hépatique que nous avons utilisés.
Les hépatocytes constituant à plus de 80% le parenchyme hépatique sont des cellules douées d’un grand pouvoir de régénération à la suite des lésions aussi bien aigues que chroniques [216]. Cette propension accrue à proliférer constitue aussi une forme d’adaptation en vue du remplacement de cellules devenues non fonctionnelles à la suite de l’agression. Bien qu’étant souvent associée à un pronostic meilleur [217], la régénération hépatique est parfois source de transformation maligne. Nous avons pu constater qu’à la suite du maquage de la protéine nucléaire Ki-67 par son anticorps spécifique, les souris Entpd8-/- présentent un faible pourcentage prolifératif lorsqu’elles sont traitées au CCl4 comparativement aux souris sauvages (Figure 15 A&B). Ce qui semble soutenir la thèse
qu’elles sont moins lesées que les souris sauvages.
Les macrophages constituent le gage de l’immunité cellulaire locale. Ces cellules sont les premières à entrer au contact de l’agresseur en vue d’initier et d’amplifier la réponse immunitaire ciblée. Lorsque les hépatocytes sont agressées ou détruites, elles libèrent des médiateurs inflammatoires qui vont activer les macrophages. Ceux-ci vont secréter des cytokines à la base de l’activation de la transformation des cellules étoilées en myofibroblastes. En évaluant la quantité de macrophages dans la fibrose hépatique, il en ressort que l’infiltration de ces cellules tend à être plus marquée chez les souris sauvages traitées au CCl4 ou à la ligature du canal biliaire commun
comparativement aux souris sauvages (Figure 16).
Quelque soit son étiologie, l’hépatite chronique débouche sur la fibrose qui est le résultat d’un processus de cicatrisation anormal [218]. Il s’y accumule une quantité importante de protéines fibreuses comme le collagène type I produites par les myofibroblastes [219]. Ces derniers proviennent de l’activation et de la transformation des cellules étoilées (HSCs) et expriment à leur
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surface, l’α-SMA [220, 221]. La quantité des myofibroblastes est souvent correlé avec la séverité de la fibrogenese hépatique [222]. Néanmoins, nous avons constaté qu’à la suite de nos modèles inflammatoires, les souris Entpd8-/- présentent une faible quantité de ces cellules par rapport aux souris sauvages.
Alors que l’existence d’un profil inflammatoire n’a pas encore été rapporté pour les souris contrôles ayant soit reçu de l’huile seule [223, 224] ou soit bénéficié d’une laparotomie sans ligature du cholédoque (SHAM) [209], nous avons observé que les souris contrôles déficientes en NTPDase8 présentaient un profil à tendance plus inflamé que les sauvages. Ce qui semble l’inverse lorsque les souris sont traitées au CCl4 ou après BDL. Nous pensons que la faible réponse des souris
déficientes traitées serait dû soit au niveau plus élevé d’expression des autres ectonucléotidases en compensation à la délétion de la NTPDase8 ou à l’inflammation, soit au niveau des récepteurs des nucléotides qui seraient désensibilisés suite à une sollicitation accrue liée à l’absence de la NTPDase8. L’évaluation des souris NTPDase8 héterozygotes permettra de répondre à cette dernière éventualité. Suite au rôle controversé des récepteurs d’adénosine dans le foie, il est également à envisager un profil plutôt proinflammatoire des récepteurs d’adénosine exprimés chez les souris NTPDase8-/-. Il n’est pas exclu que l’expression des récepteurs de nucleotides diminue à
35
Conclusion et perspectives
La fibrose hépatique est une complication qui accompagne aussi bien une exposition chronique au
CCl4 qu’une ligature du canal biliaire commun (Canal cholédoque) ou BDL. La NTPDase8 semble
jouer un rôle important dans cette entité comme nous l’avons observé en utilisant les souris
Entpd8-/-. En effet, nous avons constaté que les souris deficientes en NTPDase8 avaient tendance
à être plus inflammées à la base c’est-à-dire sans traitement, que les souris sauvages. De même, ces souris deficientes se demarquaient par leur faible réponse inflammatoire à la suite des modèles inflammatoires utilisés. Ce qui correspond à des résultats préliminaires contraires à nos prévisions. A la suite de la deletion du gène Entpd8 chez la souris, il est possible qu’une variation (redondance) non souhaitée soit introduite au niveau d’autres gènes qui codent pour des protéines impliquées dans l’inflammation, spécialement pour ce qui nous concerne directement, les recepteurs et enzymes de signalisation purinergique. Nous allons donc rechercher ce phénomène pouvant expliquer la faible réponse chez les souris deficientes en NTPDase8.
Toute expression protéique étant par ailleurs identique, et la réponse inflammatoire passant par l’activation de récepteurs P2, il n’est pas exclu que ceux-ci se trouvent précocement désensibilisés chez les souris déficientes justifiant ainsi leur faible amplification de la réponse dans ces deux modèles. Dans ce cas, la réponse des souris héterozygotes (Entpd8+/-) sera à l’extrême de celle observée chez les souris homozygotes. Par ailleurs, cela a déjà été observé avec le recepteur P2Y1
où l’on a conclu que sa desensibilisation au niveau des plaquettes sanguines explique la dysfonction plaquettaire dont notamment l’allongement de temps de saignement, observée de facon inattendue chez les souris Entpd1-/-. Les souris Entpd1+/- présentaient une plus forte déposition de fibrine dans le cœur et les poumons que les souris Entpd1-/- [93]et une augmentation de l’agrégation plaquettaire dans divers modèles dont celui de l’ischémie-réperfusion de l’intestin [225].
L’effet anti-inflammatoire des ectonucléotidases (y compris la NTPDase8) passe finalement, par la production d’adenosine grace à un relais enzymatique bien connu [226]. Les effets de l’adénosine via l’activation de ses récepteurs, sont de plus en plus controversés dans la fibrose hépatique [227]. Certains de ses récepteurs sont tantôt proinflammatoires, tantôt dotés des propriétées anti- inflammatoires [228]. Il importe donc de démeller tout ceci, dans le sens de comprendre le sens et les raisons de la faible poussée inflammatoire chez les souris Entpd8-/- dans nos deux modèles de fibrose hépatique.
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