Méthodologie

2.2.1. Préparation de l’inoculum

L’inoculum est issu d’un digesteur pilote continu de 87 L de volume utile alimenté par du lisier porcin et de l’aliment pour chevaux. La charge organique est de 3.9 kgDCO.m-3.j-1 et le temps de séjour est de

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27 jours. Les caractéristiques de l’inoculum, issu du digestat, et de l’inoculum prétraité par centrifugation sont présentées tableau 7.

Tableau 7: Caractéristiques azotées de l’inoculum non centrifugé et centrifugé.

Echantillon MS (gMS.kg-1) MV (gMV.kg-1) NTK (gN.kg-1) NH4⁺ (gN.kg-1) pH Inoculum 24.7 13.9 2.5 1.7 7.7 Inoculum centrifugé 22.8 15.7 1.2 0.4 8.3

L’inoculum non prétraité possède une teneur en matière volatile de 13.9 gMV.kg-1 ainsi qu’une teneur en azote ammoniacal de 1.7 gN-NH4⁺.kg-1 et une teneur en NTK de 2.5 gN-NTK.kg-1. L’inoculum prétraité, utilisé dans la « méthode ANMP », a été préparé par centrifugation à 10000g pendant 20 min à température ambiante. Le surnageant, contenant l’azote ammoniacal, a été retiré et le culot a été remis en suspension dans une solution de KHCO2 et NaHCO2 de 10g.L-1 de volume égal à celui du surnageant. L’ajout de cette solution tampon a permis de rétablir un pouvoir tampon afin d’éviter tout phénomène d’acidification pouvant inhiber le processus de méthanisation. Ses quantités ont été calculées en respectant les limites d’inhibition dues au sodium et au potassium (Chen et al., 2008). Le rendement de réduction de la teneur en azote ammoniacal est de 80% environ. La masse volatile ainsi que le teneur en azote organique sont très peu affectées par le prétraitement ce qui indique que la centrifugation dans ces conditions permet un bon taux de capture des MV et donc de la biomasse contenue dans l’inoculum.

2.2.2. Substrats testés

Vingt substrats issus d’installations différentes et présentant des caractéristiques différentes ont été utilisés pour l’évaluation de la méthode. Les caractéristiques des substrats sont présentées table 8.

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Tableau 8: Caractéristiques chimiques des substrats utilisés pour le développement méthodologique.

Classe Echantillons ^MS (gMS.kg-1) MV (gMV.kg-1) NTK (gN.kg-1) NH4⁺ (gN .kg-1) COT (gC.kg-1) C/N (gC/gN)

Résidus de culture _{Fèverole 140.2 125.6 6.4 0 72.4 11.3}

Vesce 174.5 158.6 8.4 0 86.5 10.3 Phacélie 216.6 197.7 2.8 0 49.9 17.8 Moutarde 178.1 158.7 5.2 0 89.2 17.3 Avoine 157.1 141.1 4.8 0 106.7 22.2 Seigle 207.6 195.6 3.6 0 128.9 35.8 Orge 246.5 221.3 4.0 0 149.1 36.8 Ensilage de maïs 298.2 275.6 6.2 0.3 133.4 21.4 Ensilage d’herbe 267.4 234.0 7.7 0.7 138.8 18.0 Ensilage d’avoine 161.9 134.0 4.2 1.9 85.6 20.5

Effluents d’élevage _{Fumier bovin 133.7 103.8 4.3 1.3 71.0 16.5}

Lisier porcin 50.3 37.1 3.2 2.3 25.1 7.7 Lisier bovin 92.4 73.4 2.4 0.9 48.3 19.7 Fumier de volaille 328.1 252.2 13.8 5.5 148.4 10.7 Déchets d’industries agroalimentaires et de collectivités

Refus de dégrillage d’abattoir 294.1 282.7 7.8 0.2 165.4 21.1

Tontes 261.4 213.3 8.1 0.4 112.0 13.8

Déchets d’aliment pour bétail 698.1 628.1 34.0 3.4 321.9 9.4

Déchets de cuisine 259.1 206.2 11.5 0.1 139.7 12.1

Déchets de production de levures 587.7 465.0 43.9 4.9 251.3 5.7

Déchets alimentaires de

supermarché ^{107.4 95.7 2.7 0.7 62.6 23.1}

La teneur en azote organique varie de 28 à 100% avec des ratios C/N de 5.7 à 39.1 traduisant la diversité de composition azotée des substrats. Tous les substrats ont été broyés à l’aide d’un broyeur rotatif (R15 V.V., Robotcoupe®) et stockés à -20°C. Les concentrations en MS, MV, NTK et ammonium ont été déterminées selon la méthode standard (APHA, 2005). Le carbone total et le carbone inorganique ont été déterminés par analyse élémentaire selon les instructions du constructeur (Thermoflash 2000, Thermoscientific®). Le carbone organique a été déterminé en soustrayant le carbone inorganique au carbone total. La détermination du BMP s’est faite selon la « méthode BMP » utilisée par Vedrenne et al. (2008).

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2.2.3. Protocole expérimental

Dans un flacon de 572 mL, le substrat et l’inoculum prétraité sont insérés. Le ratio entre substrat et inoculum est fixé à 1 gMV.gMV-1. Le volume réactionnel est atteint en complétant avec de l’eau tamponnée jusqu’à un volume de 135 mL. L’espace de tête du flacon est purgé à l’azote gazeux à un débit de 1.5 L.min-1 pendant 7 minutes. Un blanc est préparé dans les mêmes conditions, avec la même quantité d’inoculum que celle ajoutée dans le mélange. Les flacons sont incubés à 38°C avec une agitation manuelle journalière. Le suivi biogaz se fait de la même manière que sur la « méthode BMP » comme évoqué dans la section 1. Après incubation pendant 40 jours, les contenus des flacons sont analysés en NTK et azote ammoniacal afin de déterminer le potentiel de minéralisation de l’azote organique selon l’équation (13):

h =^>ij+gklgmcWm³ >i_j+lnWoe³

TgklgmcWm − [ ER^EZMUZ DqDZDUr ] (13)

Where:

- AMNP : Potentiel de minéralisation de l’azote organique du substrat (gN-NH4⁺.kg-1) - _ER^EZMUZ: Quantité totale d’ammonium dans le flacon après incubation (gN-NH4⁺) - _trUqP: Quantité totale d’ammonium dans le blanc après incubation (gN-NH4⁺) - "ER^EZMUZ: Masse de substrat ajouté dans le flacon (kg)

- [ _{ER^EZMUZ DqDZDUr} ]: Concentration d’ammonium du substrat avant incubation (gN-NH4⁺.kg -1).

Chaque substrat ainsi que le blanc est analysé en triplicat afin de déterminer l’incertitude liée à la répétabilité de la mesure. Chaque analyse physicochimique sur les contenus des flacons a été également effectuée en triplicat afin d’estimer les erreurs liées aux méthodes analytiques.

2.2.4. Estimation des incertitudes

L’incertitude de mesure sur la détermination du potentiel de minéralisation de l’azote organique a été estimée en utilisant le GUM (Guide to the Expression of Uncertainity in Measurement) (Hennebelle and Coorevits, 2013) avec une approche Monte Carlo. Le GUM est un guide décrivant les différentes méthodes possibles pour l’estimation des incertitudes de mesure d’un mesurande (grandeur à mesurer

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en prenant en compte les autres mesures qui la définissent) sur une chaine de mesure. Le mesurande est ici le potentiel de minéralisation de l’azote organique (ANMP) qui est calculé par l’équation (13). Les analyses dont les incertitudes de mesure ont été prises en compte sont les mesures des masses pesées, le NTK et le NH4⁺. L’incertitude de mesure sur la « méthode ANMP » a été effectuée par la méthode Monte Carlo. Cette méthode considère que chaque analyse suit une loi normale dont la moyenne et les écart-types sont estimés à partir d’essai de répétabilité (triplicats). Mille calculs d’ANMP ont ensuite été effectués en tirant au sort les données d’analyses au sein de ces distributions et la valeur moyenne de l’ANMP ainsi que son incertitude a été calculée en moyennant les valeurs sauvegardées et en calculant l’écart-type entre ces valeurs.

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