MÉTHODES UTILISÉES DANS LE CADRE DE CE PROJET : TESTS DE COMPÉTITION DE TYPE ELISA

1. Tests ELISA disponibles au laboratoire

Les deux tests ELISA, VEGFR1-ECD/btVEGF et VEGFR1-d1-d3/btVEGF) présentés brièvement précédemment sont réalisés en plaques 96 puits, ce qui permet de tester en parallèle différents composés. L’ensemble des protéines recombinantes utilisées pour réaliser ces tests sont commerciales et disponibles chez R&D. La méthode de détection étant de la chimioluminescence, ces tests ne nécessitent pas de conditions opératoires contraignantes et peuvent ainsi être utilisés en routine au laboratoire.

Le principe général de ces tests est représenté sur la figure 20. Le récepteur, qu’il s’agisse du domaine extracellulaire du VEGFR1 (20 ng/puits) ou seulement des domaines d1-d3 (15 ng/puits), est adsorbé sur une plaque « high binding » 96 puits. Après plusieurs lavages, la surface libre est bloquée avec de la BSA (« Bovine Serum Albumine ») afin de limiter le signal non spécifique. Les composés sont ensuite pré-incubés à la concentration souhaitée (Cette étape est effectuée uniquement lorsque les composés testés ciblent le récepteur). Le VEGF biotinylé (20 pM/puits) est ensuite additionné et entre en compétition avec les composés testés. Après cette phase d’incubation, des lavages sont effectués pour éliminer l’excès de réactifs non fixé. Afin de détecter le btVEGF lié au récepteur, un conjugué streptavidine-HRP est additionné. La plaque est ensuite lavée et le substrat de la HRP est ajouté. L’émission de lumière associée à la conversion enzymatique du substrat (eau oxygénée/luminol) est mesurée sur un lecteur de plaque. Cette dernière étape de révélation par chimioluminescence permet ainsi de déterminer le pourcentage d’inhibition de l’interaction VEGF/VEGFR1 du composé lorsqu’il est testé à une dose unique ou la valeur de CI50 lorsqu’il est testé

en effet dose.

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2. Développement d’un nouveau test ELISA : VEGFR1-d2-HRP/VEGF

Récemment, un nouveau test ELISA a été développé au laboratoire. Il est complémentaire des deux premiers et permet d’identifier des composés qui perturbent spécifiquement l’interaction entre le domaine d2 du VEGFR1 et le VEGF. Dans le cadre du développement de ce test, j’ai optimisé les conditions expérimentales (temps de pré-incubations et d’incubations, quantités de protéines utilisées et conditions de stockage des réactifs) et validé son utilisation à l’aide de différents composés et contrôles. Ce test faisant l’objet d’une publication en cours de soumission seul un résumé est présenté. L’article complet (article 1) contenant l’ensemble des détails expérimentaux et des résultats obtenus est inséré dans les pages suivantes.

Afin de développer ce test, une première approche a été d’essayer de fixer le domaine d2 du VEGFR1 sur support solide et d’utiliser, comme dans les tests VEGFR1-ECD et VEGFR1-d1-d3, du VEGF biotinylé. Cependant ce premier essai s’est révélé infructueux. En présence de btVEGF, le signal obtenu s’est avéré très faible et inexploitable. Afin d’expliquer cette absence de signal, il a été envisagé que le VEGFR1-d2 interagisse avec le support solide au niveau de la zone de reconnaissance du VEGF et par conséquent empêche ainsi la fixation du btVEGF. Dans ces conditions, une nouvelle approche a été envisagée. Celle-ci a consisté à fixer le VEGF sur la plaque et à mettre en compétition les molécules à tester avec le domaine d2 du récepteur. Une telle stratégie avait déjà été validée par Fairbrother et son équipe.203 _{Comme précisé précédemment, un test reposant sur l’utilisation du}

VEGFR1-d2 biotinylé avait déjà été décrit. Cependant le peu de données expérimentales et le fait que cette protéine biotinylée ne soit pas commerciale nous a poussés à envisager une autre stratégie. La structure cristallographique du complexe VEGFR1-d2/VEGF95 indique que les six lysines présentes sur

ce domaine du récepteur sont localisées en dehors de la zone d’interaction avec le VEGF. Par conséquent, l’approche choisie a été d’utiliser une de ces lysines pour coupler chimiquement la HRP directement au VEGFR1-d2 (Figure 21). Le couplage de cette peroxydase sur le domaine d2 du VEGFR1 ainsi que la purification du complexe formé a été réalisé dans l’équipe par le Dr. Sylvain Broussy en collaboration avec le Dr. Jean-François Gaucher et Billy Seijo (Equipe Isabelle Broutin, UMR 8015, Université Paris Descartes).

Figure 21: Couplage du VEGFR1-d2 à la HRP

Une fois couplé à la HRP, l’affinité du VEGFR1-d2 pour le VEGF a été déterminée par ELISA. Cette mesure a été effectuée en incubant du VEGF95 immobilisé sur support solide (VEGF produit par le Dr.

Jean-François Gaucher) avec le VEGFR1-d2-HRP. La liaison de ce récepteur sur le VEGF a été quantifiée par chimioluminescence après addition du substrat de la HRP. Un Kd de 5,3 nM [Intervalle

52 de confiance à 95% = 3,6 à 8,0 nM] a ainsi été obtenu. Cette valeur est en accord avec celles décrites dans la littérature. 126,127 _{Suite à ce résultat, ce conjugué VEGFR1-d2-HRP a été utilisé pour}

développer le test de compétition (Figure 22). Différentes étapes d’optimisations (quantités de VEGF et de VEGFR1-d2-HRP, temps d’incubation et de pré-incubation en particulier) ont été réalisées afin de déterminer les conditions expérimentales optimales. La première étape consiste à immobiliser le VEGF95 au fond des puits (40 ng/puits). De façon classique, la BSA est ensuite ajoutée afin de limiter

le signal non spécifique. L’étape de pré-incubation des composés semblant inutile, le VEGF est ensuite incubé en présence des composés à tester et du VEGFR1-d2-HRP (1 nM/puits). Après lavages, le substrat de la HRP est additionné et la plaque est ensuite révélée par chimioluminescence.

Figure 22 : Principe du test de déplacement VEGFR1-d2-HRP

Afin de valider ce test compétition, l’activité de différents composés connus pour se lier au VEGF ou au domaine d2 a été évaluée et comparée au données de la littérature ou aux valeurs obtenues sur les tests VEGFR1-ECD et VEGFR1-d1-d3: VEGFR1-d2, VEGF95, Bevacuzimab, anticorps anti VEGF utilisé

en clinique (Avastin®), peptide v114 et dérivés, métaux divalents. Nous avons ainsi démontré que ce test permet d’identifier des molécules capables de bloquer la liaison du VEGF sur le domaine d2 du récepteur.

En conclusion, nous avons développé un nouveau test spécifique de l’interaction VEGFR1-d2/VEGF. Celui-ci présente des avantages et des inconvénients par rapport aux autres tests déjà décrits. Il est en effet potentiellement plus sensible aux résultats « faux positifs » résultants d’une interaction imprévue entre les composés et la HRP, qui sont présents de façon concomitante dans les puits. Cet aspect doit être vérifié pour chaque série de molécules étudiée. De façon intéressante, ce test est en revanche complémentaire des tests VEGFR1-ECD et d1-d3, car il permet de définir plus précisément le site d’interaction des composés testés. De plus, le couplage de la HRP directement sur le récepteur permet de réduire le nombre d’étapes et par conséquent la durée de l’expérience. Enfin, l’ensemble des protéines est préparé en collaboration avec le Dr. Jean-François Gaucher, au sein de la faculté, ce qui permet de s’affranchir de l’utilisation de protéines commerciales.

Ces trois tests ont été utilisés tout au long de ce travail de thèse pour évaluer l’activité des composés synthétisés. Dans la suite du manuscrit, ces tests seront nommés VEGFR1-ECD, VEGFR1- d1-d3 et d2-HRP.

126 _{R. Di Stasi, D. Diana, D. Capasso, R. Palumbo, A. Romanelli, C. Pedone, R. Fattorusso and L.D. D'Andrea,} Biopolymers (Peptides Science), 2010, 94, 800-809

127 _{J.E. Stefano, J. Bird, J. Kyazike, A.W.M. Cheng, E. Boudanova, M. Dwyer, L. Hou, H. Qiu, G. Matthews, M.}

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