CHAPITRE 1 : TESTS DE DÉPLACEMENT DE L’INTERACTION VEGF/VEGFR
I. MÉTHODES EXISTANTES POUR ÉTUDIER L’EFFET D’UN COMPOSÉ SUR L’INTERACTION VEGF/VEGFR
capacité des molécules synthétisées à inhiber cette interaction. Afin de faciliter la compréhension des résultats obtenus lors de ce projet de thèse, ces différents tests seront décrits en détail dans ce premier chapitre.
I. Méthodes existantes pour étudier l’effet d’un composé sur
l’interaction VEGF/VEGFR
Comme précisé dans l’introduction, le développement de molécules capable de moduler ou bloquer l’interaction VEGF/VEGFR est une approche attrayante pour concevoir de nouveaux agents anti- angiogéniques. Différentes techniques sont décrites dans la littérature pour évaluer in vitro les propriétés inhibitrices des composés synthétisés. La partie qui suit ne vise pas à être exhaustive mais à présenter quelques exemples représentatifs de méthodes permettant d’identifier des molécules capables de bloquer la liaison du VEGF sur ces récepteurs.
1. Test de compétition sur des extraits cellulaires
Une technique classiquement utilisée consiste à observer l’effet inhibiteur d’un composé sur la fixation de VEGF radio-marqué ([125I] VEGF) sur des récepteurs (VEGFRs) présents à la surface de
cellules endothéliales (généralement de type HUVEC). Ce test de compétition peut s’effectuer directement sur des cultures cellulaires119,106,120 ou sur des préparations membranaires de cellules
fixées sur support solide121. Cette méthode peut être adaptée à des molécules ciblant soit le VEGF119
soit les récepteurs.106,121 Elle présente cependant certains inconvénients. Lorsque les molécules
testées sont des antagonistes des récepteurs au VEGF, cette technique n’apporte pas de réponse sur la nature du récepteur ciblé (VEGFR1 vs VEGFR2). Cette limitation peut cependant être contournée en utilisant des cellules surexprimant spécifiquement un type de récepteur. Une seconde limitation
119 B. Barleon, F. Totzke, C. Herzog, S. Blanke, E. Kremmer, G. Siemeister, D. Marmé and G. Martiny-Baron, J. Biol. Chem. 1997, 272, 10382-10388
120 D.G. Bae, T.D. Kim, G. Li, W.H. Yoon and C.B. Chae, Clin. Cancer Res. 2005, 11, 2651-2661
121 L.D. D'Andrea, G. Iaccarino, R. Fattorusso, D. Sorriento, C. Carannante, D. Capasso, B. Trimarco, and C.
48 est l’utilisation de VEGF radiomarqué. En effet, bien que la radioactivité soit une méthode de détection très sensible, celle-ci nécessite un équipement et un savoir-faire particulier. Enfin, l’utilisation d’extraits cellulaires est contraignante et ne permet pas l’utilisation de ce test en routine dans tous les laboratoires.
2. Test de compétition sur des protéines isolées
Une seconde approche, permettant de s’affranchir du problème de la culture cellulaire, consiste à utiliser des protéines isolées et purifiées. Cette stratégie présente également l’avantage de pouvoir obtenir plus facilement des informations sur la spécificité d’action des composés. Différentes classes de tests utilisant des protéines purifiées sont décrites dans la littérature. Ces tests peuvent être réalisés en solution ou en immobilisant un des partenaires protéiques sur une surface solide.
• Test en solution
Un test de compétition en solution permettant d’identifier des molécules capables de se lier au VEGF au niveau de la zone de reconnaissance du récepteur a été développé par Gellman et son équipe. Celui-ci utilise comme méthode de détection la polarisation de fluorescence et le principe du test repose sur la compétition de fixation sur le VEGF d’un ligand potentiel avec un peptide traceur fluorescent (dérivé du peptide v114, cf. chapitre 4).208 Ce test présente l’avantage d’être réalisé en
solution mais est cependant limité à des molécules ciblant le VEGF au niveau d’une zone restreinte.
• Test sur support solide
La majeure partie des tests utilisés sont réalisés sur support solide. Deux grandes catégories de tests de compétition sont décrites dans la littérature : d’une part celle reposant sur la technique de SPR (« Résonnance Plasmonique de Surface ») et d’autre part celle utilisant la technique ELISA (« Enzyme- Linked Immunosorbent Assay »).
La technique de SPR a notamment été utilisée par Fairbrother et son équipe afin d’identifier des peptides capables d’interagir avec du VEGF immobilisé sur la surface métallique.122
Parmi les tests sur support solide, la technique la plus rependue reste l’ELISA. Cette méthode présente l’avantage de pouvoir être miniaturisée, automatisée et réalisée par exemple en plaque 96 puits (ou plus), ce qui permet de pouvoir tester de nombreux composés en parallèle. Plusieurs exemples de tests de compétition immobilisant soit le VEGF soit le récepteur son décrits dans la littérature.
Une première possibilité consiste à immobiliser le VEGF sur support solide, l’incuber avec les composés à tester et le récepteur, puis détecter la quantité de récepteur fixé. Cette technique a
122 C. Wiesmann, H.W. Christinger, A.G. Cochran, B.C. Cunningham, W.J. Fairbrother, C.J. Keenan, G. Meng and
49 notamment été utilisée, en 2004, par Gho et son équipe.123 Dans ce test, les auteurs révèlent le
récepteur (VEGFR1 ou VEGFR2) lié au VEGF en utilisant un anticorps reconnaissant le domaine IgG du récepteur. Cet anticorps est couplé à une peroxydase, la HRP (« horseradish peroxydase »), qui en présence d’eau oxygénée et de substrat de type luminol émet de la lumière. Il s’agit donc d’une méthode de détection par chimioluminescence. Selon le même principe, Fairbrother et son équipe ont développé un test de compétition permettant d’identifier des composés capables d’inhiber spécifiquement la liaison du VEGF sur le domaine d2 du VEGFR1 (VEGFR1-d2).203 Dans ce test, du
VEGF8-109 est immobilisé sur le support solide et les molécules testées sont incubées en présence du
VEGFR1-d2 biotinylé (btVEGFR1-d2). Lorsqu’il est fixé au VEGF, ce btVEGFR1-d2 peut être révélé par chimioluminescence en utilisant un système streptavidine-HRP (la streptavidine interagissant spécifiquement avec la biotine).
Une seconde possibilité pour identifier par ELISA des composés qui inhibent l’interaction VEGF/VEGFR consiste à immobiliser le récepteur sur support solide. Il est ensuite incubé avec du VEGF et les composés à tester. Le VEGF fixé sur le récepteur peut ensuite être révélé. Un test utilisant du VEGF radio-marqué ([125I] VEGF) a notamment été développé par Shou et son équipe.103
Au sein du laboratoire, deux tests ELISA utilisant du VEGFR1 immobilisé sur support solide ont été développés de façon antérieure à mon arrivée en thèse. Ces tests mettent en compétition les composés à tester avec du VEGF biotinylé (btVEGF) et sont donc révélés par réaction de chimioluminescence à l’aide d’un système streptavidine-HRP. Le premier test est réalisé sur l’ensemble du domaine extracellulaire du VEGFR1 (VEGFR1-ECD)124 tandis que dans le second seuls
les domaines d1 à d3 du récepteur (VEGFR1-d1-d3)125 sont fixés sur le support solide.
Ces deux derniers tests ELISA ainsi qu’un nouveau système développé au cours de ce projet de thèse dans lequel du VEGF est fixé sur support solide ont été utilisés tout au long de mon travail de thèse pour évaluer d’une part l’activité des composés synthétisés et d’autre part l’effet de différents métaux sur l’interaction VEGF/VEGFR1.
123 S.J. Lee, H.M. Lee, S.T. Ji, S.R. Lee, W. Mar and Y.S. Gho, Cancer Lett. 2004, 208, 89-94
124 V. Goncalves, B. Gautier, C. Garbay, M. Vidal and N. Inguimbert, Anal. Biochem. 2007, 366, 108-110
125 B. Gautier, V. Goncalves, D. Diana, R. Di Stasi, F. Teillet, C. Lenoir, F. Huguenot, C. Garbay, R. Fattorusso, L.D.
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