Méthodes de diagnostic direct

Le diagnostic direct correspond à la détection du virus, de son génome ou des antigènes viraux. Il s’applique aux prélèvements réalisés précocement après le début des signes cliniques (entre le 1er et le 7ème jour après le début des symptômes).

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a) Techniques moléculaires :

Les techniques de biologie moléculaire se sont imposées comme l’outil de choix pour le diagnostic des arboviroses pendant la phase aiguë. La PCR conventionnelle est de plus en plus remplacée par la PCR en temps réel, plus spécifique, plus sensible, plus rapide et limitant le risque de contamination. L’extraction du génome viral est un préalable à toute réaction de PCR. Il existe des kits d’extraction manuelle des acides nucléiques sur colonnes, validés sur les prélèvements plasmatiques, céphalo-rachidiens et urinaires (QIAamp viral RNA Mini Kit, Qiagen® ; High Pure Viral RNA Kit, Roche®...)

Cependant, l’automatisation de l’extraction permet un rendu de résultats plus rapide, divers systèmes sont disponibles dans le marché (MagNaPure LC, Roche® ; Versant kPCR Molecular System SP, Siemens Healthcare® ; QIAsymphony, Qiagen® ; NucliSENS easyMAG, Biomérieux®...) [65]

La PCR en temps réel utilise le principe de base de la PCR classique (amplification cyclique d’un fragment d’ADN, basée sur une réaction enzymatique) avec pour différence une amplification mesurée non pas en final mais tout au long de la réaction, donc en temps réel.

Tous les systèmes de PCR en temps réel reposent donc sur la détection et/ou la quantification d’un émetteur fluorescent pendant le processus d’amplification, l’augmentation du signal d’émission fluorescente est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons produits durant la réaction (Figure 17).

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Il existe deux principes généraux pour la détection ou la quantification des amplicons : les agents se liant à l’ADN double brin (ex. SYBR® Green I) et les sondes spécifiques fluorescentes. Pour cette dernière catégorie, il existe quatre technologies principales : hydrolyse de sondes (Taqman assay), hybridation de 2 sondes (HybProbes), balises moléculaires (Molecular Beacons) et amorces scorpion (Scorpion primers). Les techniques commerciales de RT-PCR en temps réel ont recours essentiellement à la chimie de détection avec sondes d’hydrolyse et l’amplification se réalise en fonction des trousses sur divers thermocycleurs en temps réel disponibles sur le marché : LightCycler® 1.5/2.0/480, Roche ; Rotor-Gene® Q, Qiagen ; ABI 7500/7900®, Applied Biosystems ; CFX96 Real-Time PCR®, Bio-Rad.…) [65] .

Concernant les arbovirus, l’identification spécifique d’un genre viral requiert l’amplification des gènes cibles conservés et spécifiques tels que la région 3’ non codante pour le DENV (communes aux 4 sérotypes), la région 5’ non codante pour le WNV, le gène de la polyprotéine pour le ZIKV et les gènes des segments M et S pour les Bunyavirales (CCHFV, RVFV). Parmi les kits commercialisés, les kits RealStar RT-PCR Kit® (Altona Diagnostics) sont marqués « CE » (Figure 18), tandis que d’autres kits sont destinés uniquement à la recherche : LightMix® Kit, Roche ; Genesig® RT-PCR kit, Primerdesign et TaqMan Zika Virus Kit®, ThermoFisher (Tableau XI). Par ailleurs, ces réactifs contiennent un contrôle interne et un contrôle positif permettant de valider l’extraction et la réaction de PCR ainsi que de détecter une éventuelle inhibition. Ces kits ont été évalués en particulier pour le WNV et le DENV et ont montré une très bonne sensibilité et spécificité (> 92%) [67] [68] .

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Tableau X: Exemples de trousses de PCR en temps réel monoplex pour la détection des

arbovirus disponibles sur le marché.

Marque Kits disponibles Nombre de réactions Marquage « CE »

RealStar RT-PCR Kit® (Altona Diagnostics)

Dengue, Zika, West

Nile, Chikungunya,

Fièvre jaune, Vallée du Rift, Crimée-Congo.

96 Oui

Viasure® (Certest) Dengue, Zika, West

Nile, Chikungunya,

Fièvre jaune, Crimée-Congo

36 ou 72 (lyophilisé) Oui

Genesig RT-PCR kit® (Primerdesign)

Dengue, Zika, West

Nile, Chikungunya,

Fièvre jaune, Vallée du Rift, Crimée-Congo

150 Non

LightMix Kit® (Roche)

Dengue, West Nile,

Chikungunya, Vallée

du Rift

3x32 Non

TaqMan Zika Virus Kit® (ThermoFisher)

Dengue, Zika,

Chikungunya

96 (lyophilisé) Non

Figure 18: A gauche : Kit de PCR en temps réel (Real Star® Dengue virus) utilisé au

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Des trousses de PCR multiplexe permettant le diagnostic des plusieurs arbovirus en une seule réaction sont également disponibles : Viasure®, Certest ; Genesig® RT-PCR kit, Primerdesign et TaqMan Virus Kit®, ThermoFisher. Ils sont dédiés à la recherche simultanée des virus : DENV, ZIKV et CHIKV. Le kit Fast Track Tropical Fever® de Siemens permet quand à lui la recherche multiplexe des virus DENV, CHIKV et WNV.

Un test basé sur l’approche syndromique a été développé par Biofire/Biomérieux, il s’agit du kit « FilmArray Global Fever Panel® » permettant la détection de 19 pathogènes responsables de syndrome fébrile dont les virus : DENV, ZIKV, WNV, CHIKV, CCHFV, FJV. Ce test complètement automatisé est réalisé sur sang total, le résultat est obtenu au bout d’une heure. Son usage est cependant réservé actuellement à l’armée américaine.

b) Techniques immunologiques :

On distingue les tests de diagnostic rapide et les tests immuno-enzymatiques. Le test de diagnostic rapide (TDR) utilisé actuellement en pratique est le TDR NS1 pour le diagnostic du DENV (Figure 19). Ce test permet la détection de la protéine NS1 produite de façon importante en début de l’infection, entre J1 et J9 après le début des symptômes. Les principaux kits commercialisés sont Panbio NS1®, Bio-Rad Strip NS1® et Standard Diagnostic SD NS1®.

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Figure 19: Schéma d’un test immuno-chromatographique [69]

En termes de performances analytiques, ce test est caractérisé par une bonne spécificité (> 92%) et une sensibilité très variable (entre 48% et 82%) [70] . En effet, la sensibilité est meilleure dans les échantillons collectés dans les 3 jours après le début des signes cliniques. Par contre, une faible virémie ou une infection secondaire sont des facteurs majeurs associés à une sensibilité réduite de l’antigénémie NS1 [67].

D’autre part, des TDR combinés détectant aussi bien l’antigène NS1 que les anticorps (Ac) anti-IgG et anti-IgM anti-Dengue (One Step Dengue NS1Ag and IgG/IgM Test®, SD Bioline ; Panbio Early Rapid NS1+ Panbio Dengue Duo Cassette®, Panbio) ont été commercialisés, leur sensibilité dépasse les 88% [70].

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Des tests immuno-enzymatiques de type ELISA (Enzyme Linked ImmunoAssay) permettant la détection de l’antigène NS1 du DENV sont également disponibles : Platelia® Dengue NS1, Biorad et pan E-Dengue Early ELISA®, Panbio. Ces kits sont simples d’utilisation, automatisables et rapides.

Les performances analytiques des tests ELISA ont été estimées entre 97,9 et 100% pour la spécificité et entre 58,1 et 93,3% pour la sensibilité [67].

c) L’isolement du virus :

L’isolement du virus se base sur la détection directe du virus dans le sang du malade lors de la phase virémique. Il peut être aussi effectué à partir du LCR ou des biopsies d’organes. L’isolement viral se fait soit par inoculation intracérébrale au souriceau nouveau-né ou par inoculation intra-thoracique à des moustiques d’élevage non hématophage, mais surtout par culture sur cellules de vertébrés ou d’invertébrés (moustiques ou tiques) avec surveillance de l’apparition d’un effet cytopathogène (ECP). A titre d’exemple, le DENV est cultivable in vitro sur lignées cellulaires de moustiques (C6/36 ou AP61) ou de mammifères (Véro, LLC-MK2, BHK21). L’identification du virus en cause repose sur des techniques immunologiques ou moléculaires. Ces techniques ne sont pas utilisées en diagnostic de routine car elles sont non adaptées aux urgences (délai du résultat : 1 a 2 semaines), complexes et doivent être réalisées au sein d’un LSB 3 ce qui limite leur utilisation aux centres de référence [71].

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