CHAPITRE 2 REVUE DE LA LITTÉRATURE
2.5 Méthodes de dépistage des sources de pollution microbienne
pollution microbienne. Ces méthodes permettent de déterminer l‘origine de la pollution fécale dans des environnements aquatiques. Elles sont divisées en deux catégories : méthodes basées sur des indicateurs microbiologiques et méthodes basées sur des indicateurs chimiques.
Les méthodes microbiologiques sont phénotypiques, génotypiques, avec ou sans banque de données (Haznedaroglu et al., 2005; Plummer & Long, 2009). Les méthodes phénotypiques (non moléculaires) sont basées sur la comparaison des caractéristiques cellulaires ou physiologiques (forme, métabolisme et conditions de croissance), utilisant surtout des méthodes traditionnelles de culture. Les méthodes génotypiques comparent les séquences d‘ADN au moyen de techniques modernes moléculaires. Les méthodes dépendantes de banques de données utilisent le plus souvent E. coli et Enterococcus comme microorganismes fécaux indicateurs (Stoeckel et al., 2004). Elles consistent à choisir un microorganisme fécal indicateur d‘une source de contamination et à établir une banque de référence des isolats individuels de ce microorganisme (Booth et al., 2003). Par contre, les méthodes indépendantes de banques de données sont fondées sur la détection de marqueurs spécifiques aux hôtes afin d‘attribuer la contamination fécale à un hôte humain ou à un animal spécifique. Elles reposent le plus souvent sur l‘utilisation de
Bactéroides sp. (Bernhard & Field, 2000; Field et al., 2003).
Une nouvelle méthode de DSPM indépendante de banque de données a été développée pour identifier les sources de contamination fécale de l‘eau d‘origine humaine et animale. Elle est basée sur l‘ADN mitochondrial de cellules animales (hôtes) entraînées par les matières fécales dans l‘intestin. Cette méthode moléculaire est simple et rapide. Elle consiste à utiliser des séquences d‘ADN mitochondrial pour créer des amorces de PCR spécifiques pour l‘ADN humain et de divers animaux à l‘aide de protocoles de PCR nichée en combinaison avec la technique dot blot ou hybridation ADN-ADN (Kortbaoui et al., 2009; Martellini et al., 2005).
Les méthodes chimiques sont fréquemment utilisées pour le dépistage de la pollution humaine. L‘analyse des indicateurs pharmaceutiques est effectuée par des méthodes quantitatives, citons entre autres les méthodes colorimétrique et enzymatique, la chromatographie en phase gazeuse ou liquide et la spectrométrie de masse. Récemment, la méthode de l‘extraction en phase solide
couplée à la spectrométrie de masse en tandem (on-line SPE-LC–MS/MS) a été automatisée afin d‘analyser les contaminants organiques présents sous forme de traces dans les eaux de surface. Cette technique permet de réaliser des purifications et une concentration efficace de l'échantillon et d‘analyser des échantillons ayant des concentrations en composés d‗intérêt de l‗ordre du ng/L (Viglino, Aboulfadl, Prévost, et al., 2008). Les analytes choisis sont des agents anti-infectieux (clarithromycin, sulfaméthoxazole et triméthoprime), un anticonvulsant (carbamazépine) et son produit de dégradation (10,11-dihydrocarbamazépine), l'agent antihypertensif (enalapril), des antinéoplastiques utilisés en chimiothérapie (cyclophosphamide et méthotrexate), des herbicides (atrazine, cyanazine, et simazine) et des produits de transformation de l‘atrazine (deséthylatrazine et déisopropylatrazine) ainsi qu‘un agent antiseptique (triclocarban). Les limites de détection de la méthode développée sont faibles (entre 0,6 à 6 ng/L). (Garcia-Ac et al., 2009). Les auteurs ont critiqués les méthodes de DSPM dans plusieurs dizaines d‘articles (Field & Samadpour, 2007; Griffith et al., 2003; Meays et al., 2004; Plummer & Long, 2009; Stoeckel et al., 2004). Ils ont conclu qu‘il n‘existe pas de méthode standard pour le DSPM. Le Tableau 2.10 et le Tableau 2.11 présentent les avantages et les inconvénients de méthodes de dépistage des sources de pollution microbienne. Le choix d‘une telle ou telle méthode est basé sur différents facteurs citons entre autres, le type du bassin hydrologique, les sources potentielles de contamination et les indicateurs fécaux choisis, la différenciation entre les sources humaines et animales ou bien entre les différentes sources animales, le temps et le financement disponibles ainsi que le niveau de certitude et de résolution requis.
Globalement, des méthodes indépendantes d‘une banque de données (moléculaires et chimiques) ont été sélectionnées pour ce travail pour plusieurs raisons : (i) 60 à 80% du microbiote fécal humain est représenté par des bactéries non cultivables (Suau et al., 1999) ; (ii) l‘état de «Bactéries Viables mais Non Cultivables» est souvent rencontré dans les milieux aquatiques naturels ; (iii) l‘échappement de l‘étape de mise en culture et enfin (iv) la rapidité et la spécificité de ces méthodes.
Figure 2.10. Aperçu du dépistage des sources de pollution microbienne (DSPM) (Bernhard & Field, 2000; Booth et al., 2003; Cimenti et al., 2007; Edge & Schaefer, 2006; Field et al., 2003; Field & Samadpour, 2007; Griffith et al., 2003; Haznedaroglu et al., 2005; Meays et al., 2004; Plummer & Long, 2009; Stoeckel et al., 2004).
DSPM
Méthodes Indépendantes de
Banques de Données
Détection basée sur la culture : Bifidobacterium fermentant le sorbitol, Bifidobacterium adolescentis, B. dentium Rhodococcus coprophilus, Streptococcus bovis, Coliphages somatiques
Détection basée sur la culture :
Amplification en chaîne par polymérase d’élément répétitif avec utilisation des amorces REP (REP-PCR), BOX (BOX-PCR) ou ERIC (ERIC-PCR), Typage par séquençage de sites multiples (MLST), Ribotypage par utilisation d’une enzyme de restriction HindIII (RT- HindIII) ou EcoRI et PvuII (RT-EcoRI),
Électrophorèse en champs pulsés (PFGE), Électrophorèse sur gel dénaturant (DGGE), polymorphisme de taille des fragments amplifiés (AFLP), Polymorphisme d’ADN amplifié au hasard (RADP) Détection indépendante de culture : Polymorphisme de taille des fragments de restriction (RFLP), Polymorphisme de taille des fragments de restriction terminal (T- RFLP) séquençage de gènes (uid) de E. coli β- glucuronidase
Détection basée sur la culture : Bifidobacterium fermentant le sorbitol, Génotypage de Bactéroides, Détection indépendante de culture : PCR basée sur la spécificité aux hôtes (Rhodococcus
coprophilus), Gènes
(ARN ribosomal, protéines spécifiques aux hôtes de bactéries anaérobies comme Bacteroides et Bifidobacterium), ADN mitochondrial de l’hôte, Génotypage de F+ coliphage par hybridation, Adénovirus, Entérovirus, Biomarqueurs entérotoxines, Hybridation soustractive ciblant un seul gène spécifique, Micropuces Méthodes Phénotypiques Méthodes Dépendantes de Banques de Données Méthodes Génotypiques
Détection basée sur la culture :
Analyse de resistance aux antibiotiques (ARA, MAR et ARP), Profilage par utilisation du carbone (CUP), Analyse d’acide gras methyl ester (FAME)
Méthodes Chimiques
Tableau 2.10. Avantages et désavantages des méthodes moléculaires de DSPM (Meays et al., 2004; Scott et al., 2002).
Méthodes Avantages Inconvénients
Rybotypage Hautement reproductible, facile et permet la classification d‘isolats provenant de sources multiples
Complexe, coûteuse, méthodologie exigeante et variable, demande une banque de données locale, résultats parfois variables
Électrophorèse en champs pulsé (PFGE)
Sensible aux réarrangements
chromosomiques des souches et hautement reproductible
Sensibilité très élevée, demande une banque de données, longue manipulation
Électrophorèse sur gradient dénaturant (DGGE)
Utilisé pour des isolats Demande une banque de données, exigeante du point de vue technique, demande beaucoup de temps, pas bon pour les isolats environnementaux Amplificationen chaine par polymérase de certaines régions répétitives (Rep- PCR)
Simple et rapide Préoccupation pour la reproductibilité, demande une culture cellulaire et de grande banque de données, variabilité augmente parallèlement avec la taille de banque de données
Length
heterogeneity PCR (LH-PCR)
Ne demande ni culture ni banque de données
Équipements coûteux, méthodologie exigeante Polymorphisme de longueur des fragments de restriction terminaux (T- RFLP)
Ne demande ni culture ni banque de données
Équipements coûteux, méthodologie exigeante Marqueur ciblant l’ADNr 16S, spécifique à l’hôte (combinaison de LH-PCR et T- RFLP)
Ne demande ni culture ni banque de données, indicateur de pollution récente (Bacteroidales, Bifidobacterium)
Seulement testée sur des marqueurs humains et bovins, équipements coûteux, méthodologie exigeante, peu
d‘informations sur le devenir de
Bacteroides spp. dans l‘environnement
MAR (résistance multiple aux antibiotiques)
Rapide et permet de différencier les sources de contamination animale
Demande une banque de données, variable géographiquement, absence des isolats non résistants aux antibiotiques BOX-PCR Rapide et facile Demande une banque de données locale
Tableau 2.11. Principaux avantages et inconvénients des méthodes de culture/sans culture et des méthodes dépendantes/indépendantes d‘une banque de données (Ahmed et al., 2009; Field & Samadpour, 2007; Gilpin et al., 2002; Roslev & Bukh, 2011; Young et al., 2008b).
Méthodes Avantages Inconvénients
Avec culture - Peu coûteuses - Accès technique aisé - Augmentation du nombre de microorganismes cibles pendant la phase de croissance exponentielle - Différenciation entre les contaminations humaines et animales
- Limités à des souches cultivables
- Changement drastique de la composition de communautés microbiennes après culture - Semi-quantitative
- Souches peu spécifiques de l‘hôte
- Pas de différenciation entre les espèces animales - Manipulations intensives
- Besoin de nombreux échantillons
- Faible stabilité géographique de la banque de données
Tableau 2.11. Principaux avantages et inconvénients des méthodes de culture/sans culture et des méthodes dépendantes/indépendantes d‘une banque de données (Ahmed et al., 2009; Field & Samadpour, 2007; Gilpin et al., 2002; Roslev & Bukh, 2011; Young et al., 2008b) (suite).
Méthodes Avantages Inconvénients
Sans culture - Détection de bactéries cultivables et non cultivables - Représentation plus large de la population microbienne - Différenciation entre les contaminations humaines et animales
- possibilité d‘une étape d‘enrichissement
- Quantitatives (selon le choix) - Simple
- Réponse rapide (quelques heures)
- Matériels et équipements onéreux
- Peu de corrélation avec les indicateurs classiques et les pathogènes
- Persistance des cibles non déterminée - Stabilité géographique non déterminée
Dépendantes d’une banque de données
- Discrimination entre les contaminations humaines et animales
- Rapide
- Inexactitude sur le terrain - Classifications erronées - Faux positives
- Résultats négatifs
- Manque de spécificité à l‘hôte (E. coli et entérocoques)
- Besoin des banques de plus en plus larges et représentatives
- Animaux sauvages mal représentés
- Banque de données n‘est pas toujours cosmopolite - Laborieuses et coûteuses
Indépendantes d’une banque de données
- Pas besoin de banque à chaque site
- Discrimination entre les contaminations humaines et animales
- Rapide - Quantitative
- Manque de spécificité absolue à l‘hôte entre les marqueurs microbiens associés aux humains et aux animaux
- Manque de stabilité temporelle de certains marqueurs microbiens dans différents groupes d‘hôtes
- Transfert horizontal de gène de marqueurs avec des toxines et/ou des gènes virulents
- Marqueurs microbiens peu abondants chez certains hôtes et/ou populations
- Besoin d‘un nombre plus grand de gènes cibles différents (spécifiques)
- Faux positifs dépendant de l‘alimentation (ex, marqueur mitochondrial bovin retrouvé dans des selles humaines où les individus avaient consommé de la viande bovine)