Méthodes d’analyse de la cocaïne et de ses métabolites

Avant de pouvoir évaluer différentes voies de synthèse pour des MIP imprimés avec de la cocaïne, des méthodes d’analyse ont été développées pour quantifier les molécules cibles dans les différentes fractions résultant du protocole d’extraction. Les molécules étudiées sont la cocaïne, et ses métabolites principaux, la BZE et l’EME. Malgré les propriétés hydrophiles des deux métabolites (voir Tableau I- 1), la plupart des méthodes de séparation utilisées pour leur analyse se font avec de la chromatographie à polarité de phase inversée [30, 50, 51]. Donc dans les deux cas, pour la LC-UV et la LC-MS, la séparation chromatographique a été effectuée avec une colonne remplie de silice greffée C18 (Symmetry Shield RP18, Waters) de dimensions 150 mm x 2,1 mm d.i., avec un diamètre de particules de 3,5 µ m.

Pour le développement de la méthode en LC-UV, seules la cocaïne et la BZE ont été étudiées car l’EME n’a pas de groupements chromophores et elle n’est donc pas détectable en UV. La détection a été réalisée par spectrophotométrie UV avec un détecteur à barrettes d’iodes et la quantification a été réalisée à une longueur d’onde de 233 nm pour les deux molécules. Une phase mobile appliquée en mode gradient et constituée d’un tampon formate d’ammonium 5 mM pH = 3,2 et de MeCN à un débit de 0,2 mL min¯1 a été choisie car elle permet la séparation des deux molécules en moins de 8 minutes. En plus, il s’agit d’une phase mobile qui pourrait être transposable à l’analyse par LC-MS. Enfin, le mode gradient a été utilisé pour pouvoir par la suite faire l’analyse d’échantillons réels tout en nettoyant la colonne analytique après chaque injection. La méthode complète est détaillée en annexe 2 sous le nom de méthode LC-UV. Les pics obtenus ont des aires assez proches. Une bonne linéarité de la méthode a été observée entre 0,05 µg.mL-1 et 0,5 µg.mL-1 avec des coefficients de régression linéaire supérieurs à 0,999 pour les deux molécules. Avec cette méthode et en injectant un volume de 20 µ L, les LDD, correspondant à un rapport de signal sur bruit de 3 (S/B = 3), sont de 3 ng.mL-1 et 2 ng.mL-1 pour la cocaïne et la BZE respectivement. Les LDQ, pour lesquelles le rapport signal sur bruit est égal à 10 (S/B = 10), sont de 10 ng.mL¯1 et 7 ng.mL¯1 pour la cocaïne et la BZE respectivement. Un chromatogramme correspondant à l’analyse de ces deux composés est présenté en Figure III- 1.

Figure III- 1 : chromatogramme LC-UV d’une solution d’eau avec 10 % de MeCN dopée avec 50 ng.mL-1 de cocaïne et de BZE. Détection UV à λ = 233nm. Gradient tampon formate d’ammonium

5 mM pH = 3,2 et MeCN. Débit = 0,2 mL.min-1. Vinjection = 20 µL. Température = 35°C. Méthode

décrite en annexe 2 comme méthode LC-UV.

Considérant que la sensibilité reste faible pour ce type de détection, lors de l’étude de profils d’extraction, une évaporation totale des fractions a été réalisée, suivie d’une reprise avec

200 µ L d’une solution eau/MeCN 90/10 (v/v). En effet, cette procédure permet non seulement d’avoir un échantillon compatible avec la phase mobile au début du gradient, mais aussi de pré-concentrer les analytes cinq fois avant leur analyse par LC-UV.

III.1.2 Analyse par LC-MS

La méthode d’analyse par LC-MS a été développée pour la séparation et quantification de la cocaïne et ses deux métabolites principaux. Le système utilisé ici ainsi que les paramètres de détection sont les mêmes que dans le cas de la méthode décrite dans le chapitre II pour la LC- MS conventionnelle, mais la colonne analytique utilisée dans cette partie est celle de la méthode LC-UV présentée dans ce chapitre. Il s’agit donc d’une colonne remplie de silice greffée C18 Symmetry Shield RP18 (Waters, 150 mm x 2,1 mm d.i., 3,5 µm). Le gradient et la composition de la phase mobile sont différents par rapport à la méthode LC-UV utilisée pour l’étude de la cocaïne et la BZE seules. La phase mobile est constituée d’eau (A) et de MeCN (B) avec 0,1 % d’acide formique pour les deux. Finalement, le tampon formate d’ammonium n’a pas été utilisé car des signaux plus importants ont été obtenus avec de l’eau acidifiée avec 0,1 % d’acide formique. Un gradient a été utilisé car l’EME étant une molécule très polaire, elle est éluée pratiquement au temps de rétention nulle même avec une phase mobile 100 % aqueuse. Le débit utilisé est de 0,2 mL.min-1 et le volume injecté est de 5 µ L. Le gradient commence à 0 % de B jusqu’à 1,5 minutes, puis il augmente de 0 % jusqu’à 15 % en 1,5 minutes, ensuite il reste à 15 % pendant 5 minutes, et enfin il augmente jusqu’à 80 % en 2 minutes et reste à 80 % pendant 1 minute. Cette méthode sera par la suite nommée LC- MS Symmetry Shield, et elle est présentée en détail dans l’annexe 2. Les chromatogrammes correspondant à cette méthode sont présentés sur la Figure III- 2.

L’optimisation des paramètres de détection du triple quadripôle avait été réalisée dans le chapitre II, donc les chromatogrammes obtenus correspondent aux transitions suivantes :

Cocaïne (COC) : m/z = 304 → m/z = 182 Benzoylecgonine (BZE) : m/z = 290 → m/z = 168 Ecgonine méthylester (EME) : m/z = 200 → m/z = 182

On constate que le pic de cocaïne et celui de BZE sont inversés pour la première fois, en effet, le changement de phase mobile a modifié fortement les interactions de ces molécules avec la phase stationnaire. On peut aussi noter que pour la colonne Zorbax SB18 utilisée en méthode conventionnelle dans le chapitre II (Annexe 2, méthode LC-MS conventionnelle), il n’y avait pas eu cet inversement des pics, donc les interactions avec la colonne Symmetry Shield utilisée ici semblent être assez différentes de celles de la colonne Zorbax SB18.

Figure III- 2 : Chromatogrammes LC-MS des transitions MRM de la cocaïne, la BZE et l’EME d’une solution dopée avec 0,5 ng.mL-1 de chacune des molécules cibles. Méthode LC-MS Symmetry Shield

décrite en annexe 2.

Dans ces conditions de travail, la cocaïne et la BZE sont séparées avec une résolution de 1,3 et le pic d’EME ne se trouve pas tout à fait au temps mort (k = 0,3). Les LDD sont de 0,02 ng.mL-1, 0,08 ng.mL-1 et 0,04 ng.mL-1 pour la cocaïne, la BZE et l’EME respectivement. Les LDQ obtenues pour cette méthode sont de 0,08 ng.mL-1, 0,20 ng.mL-1 et 0,53 ng.mL-1 pour la cocaïne, la BZE et l’EME respectivement. Une bonne linéarité a été obtenue pour un intervalle de concentration entre 0,5 ng.mL-1 et 10 ng.mL-1 pour les trois molécules avec des coefficients de corrélation de régression linéaire supérieurs à 0,998 pour les trois molécules. Grâce à ce mode de détection beaucoup plus sensible, le gain en sensibilité est de l’ordre de 500 pour la cocaïne et de 100 pour la BZE par rapport à la détection UV. Nous disposons donc de deux méthodes plus ou moins sensibles, utilisables en fonction de la disponibilité des appareils, pour la caractérisation des MIP.