Description des puces et de l’instrumentation utilisées

Dans le contexte de la miniaturisation pour l’analyse de traces dans des matrices biologiques, la cocaïne et son métabolite principal, la BZE, ont été choisies en tant que molécules modèles pour l’application de la SPE-LC sur puce couplée à la spectrométrie de masse. Le système utilisé pour cette étude est en effet une puce commerciale en polyimide schématisée en la Figure II- 1.

Figure II- 1 : Schéma de la puce commerciale étudiée (source Agilent).

Le polyimide est un copolymère de 4-4’-diaminodiphenyl éther et d’anhydride téréphtalique [199] qui est compatible avec la plupart des solvants organiques et qui est stable mécaniquement, thermiquement et chimiquement dans un large intervalle de pH. Pour l’élaboration du dispositif expérimental, les canaux et les ports sont tout d’abord formés par ablation laser sur des films de polyimide. Les canaux ainsi obtenus sont de forme carrée de 75 µm de côté. Puis des contacts électriques en platine sont déposés sur la puce par sublimation pour pouvoir appliquer par la suite une tension pour former l’électrospray. Les films de polyimide utilisés ont une couche co-extrudée de polyimide thermoplastique, ce qui facilite le collage des différentes couches sous pression et chaleur. L’ablation laser est ensuite utilisée pour donner la forme finale à la puce et à l’aiguille de nanoélectrospray. Cette aiguille a finalement une forme conique d’une longueur de 2 mm et d’un diamètre externe qui va de 35 µm à 100 µm.

Outre son aiguille de nanoélectrospray, la puce intègre un canal d’enrichissement et un canal de séparation. Les deux canaux sont remplis de particules sphériques de phase stationnaire de 5 µm de diamètre. Le remplissage des canaux se fait par suspension en appliquant une procédure adaptée d’une méthode préalablement utilisée pour le remplissage de capillaires en silice [200]. Ce système ne nécessite pas de frittés car la phase stationnaire est retenue par un effet « keystone ». En effet, les dimensions se réduisent à l’extrémité des canaux, et lors du remplissage avec des particules, leur densité au niveau de la restriction augmente ce qui

entraîne leur agrégation et donc leur immobilisation dans le canal [173]. Les volumes du canal d’enrichissement disponibles à l’heure actuelle sont de 40 nL, 160 nL et 500 nL conduisant donc à des quantités de phase variées. Les deux canaux sont remplis d’une même phase stationnaire. Trois phases différentes sont actuellement disponibles : de la silice greffée C8 et C18, et du carbone graphite poreux avec des porosités de 80 Å et 300 Å. Les trois puces testées dans cette étude contiennent des particules de Zorbax SB C18 avec des porosités de 80 Å pour la puce à très grande capacité, et de 300 Å pour les 2 autres puces. Le canal de séparation présente une coupe transversale carrée de 75 µm de côté et sa longueur peut être de 43 mm ou 150 mm. Pour ce travail, trois puces ont été testées, une puce avec une capacité de 40 nL et une longueur de canal séparatif de 43 mm, une puce de grande capacité (160 nL) et une puce de très grande capacité (500 nL), ces deux dernières ayant une longueur de canal séparatif de 150 mm. Les caractéristiques des trois puces évaluées sont reportées dans le Tableau II- 1.

Tableau II- 1 : Caractéristiques des puces évaluées.

Une interface permet de connecter la puce au système de pompage et au spectromètre de masse. Cette interface, nommée « chip cube », est présentée en Figure II- 2. La puce se place à l’entrée du « chip cube » et elle est alors intercalée entre le rotor et le stator d’une vanne rotatoire à l’intérieur de l’interface. Cette vanne permet de positionner la puce de façon à avoir l’aiguille d’électrospray à l’entrée du spectromètre de masse. Elle permet aussi de faire des connexions étanches entre la puce et les pompes. Comme dans une vanne 6 voies classique, le rotor est constitué de trois canaux intercalés au niveau des pores de la puce deux à deux, et les connexions des liquides se font au niveau du stator. Le stator est fixé à un bras de serrage qui permet l’alignement des ports du stator avec les ports de la puce et avec les canaux du rotor [183]. La vanne est pilotée par le logiciel Mass Hunter (Agilent Technologies, Massy, France). Une fois que la puce est placée et alignée à l’intérieur de l’interface, la vanne rotative peut passer d’une position d’enrichissement à une position d’analyse en basculant de 60°.

Puce Simple Grande capacité Très grande capacité

Phase stationnaire Zorbax SB C18 5 µm Zorbax SB C18 5 µm Zorbax SB C18 5 µm

Porosité 300 Å 300 Å 80 Å

Dimensions du canal de

séparation 43 mm x 75 µm x 75 µm 150 mm x 75 µm x 75 µm 150 mm x 75 µm x 75 µm Dimension du canal

Figure II- 2 : Schéma de l’interface « chip cube ».

La configuration de la puce, schématisée en Figure II- 3, est semblable à celle d’un couplage SPE-LC en ligne conventionnel. Dans la position d’enrichissement (Figure II- 3(A)), la pompe analytique est connectée à la colonne de séparation pour équilibrer la phase dans le canal séparatif, tandis que le canal d’enrichissement est connecté directement à l’injecteur. Cette position est utilisée pour le chargement de l’échantillon dans la zone d’enrichissement. En effet, l’échantillon est prélevé dans la boucle de l’injecteur puis est poussé à travers un capillaire en polyétheréthercétone (PEEK) vers le canal d’enrichissement par une pompe de chargement branchée directement sur la vanne de l’injecteur. Le transfert de l’échantillon de la boucle de l’injecteur vers le canal d’enrichissement peut être contrôlé soit par un programme temporalisé pour basculer la vanne de l’injecteur et la vanne rotatoire de la puce, soit par une fonction automatique du logiciel (nommé « chargement intelligent de l’échantillon ») [201].

Figure II- 3 : Schéma des connexions de la puce dans la position d’enrichissement (A), et dans la position d’analyse (B) en mode « forward flush ».

Le premier mode de contrôle est celui rencontré généralement pour des couplages conventionnels SPE-LC, mais il nécessite d’une nouvelle optimisation lors d’un changement de volume injecté. Dans le deuxième mode de contrôle, le logiciel calcule automatiquement le temps de chargement de l’échantillon basé sur le débit de la pompe de chargement, le volume d’injection et le volume des capillaires qui font la connexion du siège d’injection jusqu’au canal d’enrichissement. Dans le cadre de ce travail, le mode automatique a été utilisé. Un paramètre doit être cependant défini pour ce mode automatique, il s’agit du volume de transfert ou « flush volume » (Vflush) qui correspond au volume qui doit assurer le transfert de l’échantillon de la boucle d’injection vers la zone d’enrichissement. Il est donné par la formule suivante :

Vflush = (Vsiège + Vfiltre + Vtransfert) . x = V0 x

Vsiège est le volume du capillaire du siège d’injection, Vfiltre est le volume des capillaires qui relient le filtre en ligne au reste du système, ce filtre étant placé entre la vanne d’injection et le capillaire de transfert, Vtransfert est le volume du capillaire qui relie l’injecteur au canal d’enrichissement de la puce, et x est un facteur qui définit le nombre de volumes morts (V0) utilisés pour transférer l’échantillon. Les capillaires utilisés ont les dimensions suivantes :

• Vsiège = 1,178 µ L (Capillaire de siège 100 µm x 150 mm)

• Vfiltre = 0,3 µ L

• Vtransfert = 0,515 µL (Capillaire de transfert 25 µm x 1050 mm) V0 est donc égal à : 1,178 + 0,3 + 0,515 = 1,993 µ L

t(chargement) = (Vflush + Vinjection) / débit pompe de chargement

Le débit de la pompe de chargement est défini dans la méthode. Le volume de transfert permet donc non seulement le chargement de l’échantillon de la boucle d’injection vers le canal d’enrichissement mais aussi une étape de lavage si x >1. Par conséquent, dans la position d’enrichissement il est possible de faire les étapes de chargement de l’échantillon et de lavage. Par la suite, l’élution se fait par la phase mobile en basculant la vanne dans la position analyse (Figure II- 3(B)). Comme dans une procédure SPE en ligne classique, il est nécessaire de définir plusieurs paramètres de la méthode sur puce pour s’assurer du transfert approprié des analytes vers la colonne de séparation. Cela implique aussi dans un premier temps d’optimiser les conditions de détection.

II.1.2 Optimisation des paramètres de la détection par spectrométrie de