Application du MIP dans le sérum

Le MIP a montré un fort potentiel pour l’analyse de traces de cocaïne, BZE et EME dans un milieu organique tel que le MeCN. Des applications à l’analyse d’extraits de cheveux ont démontré qu’il était possible de nettoyer cette matrice pour obtenir des chromatogrammes propres et pour pouvoir quantifier les molécules cibles en LC-UV et en LC-MS. Cependant, les extraits de cheveux restent une matrice biologique assez propre et ne permettent donc pas d’observer le vrai potentiel des MIP pour le traitement d’échantillons complexes. Contrairement aux cheveux, des échantillons biologiques tels que le sérum sont des matrices très complexes pour lesquelles le traitement de l’échantillon est une étape incontournable pour l’analyse quantitative.

Précédemment, la rétention de la cocaïne et ses métabolites dans un milieu hydro-organique a été étudiée (Figure III- 12). Cette étude a montré la nécessité d’étudier la rétention de la BZE dans un milieu hydro-organique en fonction du pH de l’échantillon à cause de la nature zwitterionique de ce métabolite que l’on cherche à retenir sur un support contenant des résidus de MAA ionisables. Pour cette étude, des échantillons de sérum, dont les protéines majoritaires ont été préalablement précipitées avec du MeCN (50 % v/v), ont été dopés avec de la cocaïne et de la BZE à 1 µ g.mL-1 et percolés sur le MIP et le NIP (annexe 4). L’utilisation de sérum au lieu de solution hydro-organiques pures permet effectivement d’évaluer non-seulement l’effet du pH mais aussi celui des autres molécules interférentes se retrouvant dans la matrice biologique notamment les sels. Avant de réaliser l’étude de la rétention en fonction du pH de percolation, il a été nécessaire d’évaluer l’impact de la matrice de l’échantillon sur la rétention de la cocaïne et de la BZE. La rétention de l’EME n’est pas testée pour cette étude puisque ses propriétés acido-basiques sont assez proches de celles de la cocaïne, et donc la cocaïne pourra servir de référence.

III.5.2.1 Évaluation des effets de la matrice sérum sur les profils d’extraction

Une série de protocoles d’extraction a été testée en milieu sérum avant de réaliser l’étude du pH de l’échantillon. Sur le Tableau III- 6 sont présentés les différents protocoles étudiés et sur la Figure III- 27 les profils d’extraction de la cocaïne correspondants.

Étape Percolation Lavages Élution Quantité de

MIP UV Profil 1 1mL COC et BZE 0,5 µg.mL-1 _en

sérum/MeCN 50/50 (v /v) 1 mL MeCN 100 % 1 mL MeCN/MeOH 97,5/2,5 (v/v) 2mL MeCN/MeOH 97,5/2,5 (v/v) 25 mg

Profil 2 0,5mL COC et BZE 0,5 µg.mL-1 _en

sérum/MeCN 50/50 (v/v)

25 mg

Profil 3 0,5mL COC et BZE 1 µg.mL-1 _en

sérum/MeCN 50/50 (v/v)

50 mg

Tableau III- 6 : Protocoles d’extraction testés en milieu sérum/MeCN 50/50 (v/v) pour le MIP et son NIP correspondant.

Figure III- 27 : Profils d’extraction de la cocaïne d’un échantillon de sérum dopé après la précipitation des protéines par du MeCN. Les protocoles correspondant à chaque profil sont détaillés sur le Tableau

III- 6.

La Figure III- 27 ne présente que les profils d’extraction de la cocaïne car pour la BZE les résultats sont assez semblables à ceux obtenus en milieu hydro-organique, c'est-à-dire qu’elle est éluée du MIP à plus de 70 % lors de la percolation. Pour le profil 1, le même protocole que celui utilisé en milieu hydro-organique a été appliqué mais pour une quantité plus faible de cocaïne percolée. Il apparaît que 45 % de ce composé est élué du MIP lors de la percolation, indiquant une influence des composés du sérum traité sur la rétention de la cocaïne. Afin de

favoriser la rétention, le volume de percolation a été réduit à 0,5 mL (profil 2) pour que la quantité d’interférents soit moins importante. Effectivement, une meilleure rétention est obtenue pour la cocaïne puisqu’elle est retenue sur le MIP lors de la percolation. Cependant, lors des lavages, environ 50 % de la cocaïne est éluée du MIP, soulignant encore l’impact du milieu sur la rétention de la cocaïne. Finalement, pour favoriser la rétention de la cocaïne en augmentant le nombre de sites spécifiques, la quantité d’adsorbant a été doublée (profil 3). Cette fois-ci une bonne sélectivité est obtenue avec un rendement pour le MIP à l’élution de 85 %. Donc, pour la suite de l’étude du pH de percolation, ce sont les conditions correspondant au profil 3 qui ont été utilisées, c’est-à-dire basé sur l’utilisation de 50 mg de MIP.

III.5.2.2 Influence du pH sur la rétention des analytes ciblés sur le MIP

La Figure III- 28 présente les taux de récupération de la cocaïne et la BZE dans la fraction d’élution (Figure III- 28 (a)) ainsi que les pourcentages de cocaïne et de BZE élués lors de la percolation (Figure III- 28 (b)) en fonction du pH de la solution de percolation pour un pH compris entre 3 et 11. La préparation des échantillons de sérum est décrite en annexe 4.

Figure III- 28 : Pourcentage de cocaïne et de BZE des fractions d’élution (a) et de percolation (b) en fonction du pH après application du protocole d’extraction du profil 3 (Tableau III- 6).

Pour la cocaïne (pKa = 8,6), les rendements sur le MIP augmentent entre pH = 3 et pH = 8, puis ils diminuent très rapidement pour des pH > 8 (Figure III- 28 (a)). De la même façon, la rétention de la cocaïne sur le MIP UV à la percolation (Figure III- 28 (b)) augmente entre pH = 3 et pH = 8, puis diminue pour pH > 8. Les interactions spécifiques de la cocaïne avec le MIP semblent être principalement des interactions électrostatiques entre le groupement amine protoné de la cocaïne et les groupements acides déprotonés des résidus de MAA intégrés dans la chaîne polymérique du MIP. Le pKa de la cocaïne étant égal à 8,6 (Tableau I- 1), son

groupement amine se trouve sous forme protonée pour pH < pKa, et à des pH proches ou supérieurs à 8,6, la cocaïne se trouve déprotonée et les interactions électrostatiques ne sont plus possibles, d’où la chute du rendement à pH > 8. En ce qui concerne les groupements acides de la chaîne polymérique, une étude a montré que le pKa du MAA au sein du polymère est proche de 6,8 [134], donc le pH doit être supérieur à 6,8 pour que les groupements acides soient déprotonés. La baisse du rendement d’extraction de la cocaïne sur le MIP UV pour des pH < 7 est donc bien justifiée puisque les résidus acides de monomère du MIP se trouvent protonés et donc non chargés. Les rendements sont finalement les plus élevés pour un intervalle de pH entre 7 et 8. Comme le pH du sang est égal à 7,4, il ne sera donc pas nécessaire d’ajuster le pH des échantillons pour l’extraction sélective de la cocaïne. Cependant, cette étude a principalement été réalisée pour améliorer la rétention de la BZE, mais malheureusement le rendement du MIP pour cette molécule ne dépasse pas 5 % dans tout le domaine de pH testé. En effet, dans tout cet intervalle de pH, une importante quantité de BZE (> 60 %) est perdue dès la percolation. Donc, même si des lavages moins éluants étaient utilisés, il ne serait pas possible de développer un protocole d’extraction sélectif pour la BZE dans ce milieu car elle n’est même pas retenue à la percolation. Ce manque de rétention de la BZE doit certainement être lié à la présence du groupement acide carboxylique, dont le pKa est égal à 2,25. La BZE a effectivement une charge négative dans tout l’intervalle de pH testé et elle doit alors certainement subir des répulsions avec les groupements MAA déprotonés de la chaîne polymérique, ce qui empêche sa rétention ; rétention qui n’est pas plus facilitée en milieu hydro-organique compte tenu du caractère polaire de cette molécule.

III.5.2.3 Performances de la méthode

La répétabilité de la méthode développée précédemment pour l’extraction de la cocaïne a été évaluée après élimination du deuxième lavage, c’est-à-dire le lavage avec un mélange MeCN/MeOH 97,5/2,5 v/v, celui-ci n’étant pas vraiment nécessaire au regard des résultats obtenus pour le profil 3 de la Figure III- 27. Donc pour évaluer la répétabilité de l’extraction de la cocaïne en milieu sérum, des échantillons de 0,5 mL de sérum après précipitation des protéines par l’ajout de 50 % de MeCN, dopés avec 1 µg.mL-1 de cocaïne et sans ajustement de pH, ont été percolés. L’élution a été réalisée avec 2 mL d’une solution de MeOH avec 5 % d’acide acétique après le lavage des cartouches avec 1mL de MeCN pur. Les résultats sont présentés sur la Figure III- 29.

Figure III- 29 : Profils d’extraction de la cocaïne sur le MIP et le NIP obtenus après percolation de 0,5 mL d’un échantillon de sérum traité par 50 % de MeCN, dopé avec 1 µg.mL-1 de cocaïne (n = 3).

Lavage : 1 mL de MeCN, élution : 2 mL MeOH/acide acétique 95/5 v/v.

Le protocole conduit à une bonne rétention de la cocaïne, une excellente sélectivité et une bonne répétabilité, avec des rendements de 101 ± 7 % pour le MIP et de 0,6 ± 1 % pour le NIP à l’élution (n = 3). Ce même protocole a été appliqué à des échantillons de sérum dopés au seuil décisionnel de positivité dans le sang, c’est-à-dire à 50 ng.mL-1 (Tableau I- 2). Les chromatogrammes obtenus par LC-UV correspondants sont présentés sur la Figure III- 30.

Figure III- 30 : Chromatogrammes LC-UV d’échantillons de sérum dopés avec 50 ng.mL¯1 de cocaïne (pic montré par une flèche), avant extraction (ligne continue), et après l’extraction avec le MIP (tirets).

L’intérêt de l’utilisation du MIP est bien justifié puisque le chromatogramme correspondant à l’élution du MIP est plus propre que celui obtenu avant l’extraction. Il est donc possible de faire un dépistage dans le sang avec une détection par UV après l’extraction sélective de la cocaïne du sérum par le MIP après une simple étape de précipitation de protéines. La détection en MS serait toutefois nécessaire pour atteindre des niveaux de quantification plus faibles, notamment pour l’étape de confirmation où le seuil de positivité se trouve à 5 ng.mL-1 (Tableau I- 2) avec un moindre risque de perturbation de l’ionisation de la cocaïne grâce à la sélectivité apportée par le MIP.

III.5.2.4 Extraction de l’EME du sérum humain sur MIP

Considérant que l’EME est aussi un métabolite couramment détecté dans le sang et qu’il n’a pas de fonction acide, le protocole d’extraction optimisé pour la cocaïne a été évalué pour l’extraction de l’EME (Figure III- 31).

Figure III- 31 : Profils d’extraction de l’EME obtenus avec le MIP et le NIP après percolation de 0,5 mL d’un échantillon de sérum traité par 50 % de MeCN et dopé 50 ng.mL-1 d’EME.

Lavage : 1 mL MeCN, élution : 2 mL MeOH/acide acétique 95/5 v/v.

Dans ces conditions, l’EME n’a pas été retenue sur le MIP à la percolation. Le pKa du groupement amine de l’EME est de 9,3, elle se trouve donc protonée au pH physiologique et peut développer, comme la cocaïne, des interactions électrostatiques avec les cavités spécifiques du MIP. Par contre, l’EME est plus polaire que la cocaïne et de plus petite taille, ceci peut donc expliquer que son affinité pour les sites de reconnaissance soit inférieure. Néanmoins, en comparant les profils en milieu hydro-organique (Figure III- 12) et en milieu sérum (Figure III- 31), on observe que la rétention s’affaiblit d’avantage en milieu sérum puisque l’EME est éluée à 80 % dès la percolation. Les ions présents dans la matrice sérum doivent être à l’origine de ce manque de rétention puisqu’ils entrent en compétition avec l’EME pour interagir avec les sites de reconnaissance spécifique. Si la cocaïne subit moins cet effet c’est parce qu’elle est moins polaire et donc qu’elle compense à priori les interférences agissant sur les interactions électrostatiques par une rétention par effet hydrophobe en milieu hydro-organique. Ceci implique que la dilution par de l’eau de l’échantillon pour abaisser le pourcentage en MeCN utilisé pour la précipitation des protéines peut permettre une amélioration de la rétention de l’EME. D’ailleurs, dans la partie précédente, il a été observé qu’en milieu aqueux pur, l’EME peut effectivement être retenue et même extraite sélectivement par le MIP. Cependant, les interactions sélectives observées en milieu aqueux pur peuvent, comme observé pour le sérum, être sujettes à des phénomènes de compétition

dans un milieu plus complexe. Il est donc important de le vérifier et le milieu biologique aqueux choisi pour cette étude est l’urine.