Méthodes culture-dépendantes

Le pyroséquençage, première technique SNG disponible dans le commerce, a connu l'utilisation la plus vaste en microbiologie alimentaire. Il a été utilisé pour étudier la diversité bactérienne d'un certains nombres d'aliments fermentés (Humblot and Guyot, 2009; Nam et al., 2012; Chao et al., 2013; Nalbantoglu et al., 2014). Le marché des séquenceurs SNG est couvert par 3 grands groupes ; Roche, Illumina et Life Technologies. Les deux types de séquenceurs SNG couramment utilisés pour le profilage des communautés microbiennes sont le 454-Roche et Illumina (Bokulich and Mills, 2012).

3.2 Méthodes culture-dépendantes

Les méthodes culture-dépendantes nécessitent l’isolement et la culture des souches préalablement à leur identification selon leurs caractéristiques phénotypiques et/ou génotypiques. Leur identification est effectuée principalement par le biais des méthodes biochimiques et phénotypiques. Néanmoins, les méthodes phénotypiques, traditionnelles, sont souvent insuffisantes pour identifier de manière fiable de nombreuses espèces et/ou les souches spécifiques dans les communautés microbiennes complexes. Cela a conduit au développement des méthodes d'identification moléculaire, en particulier celles basées sur la PCR. L'automatisation de nombreuses techniques couplée au développement des statistiques et de la bioinformatique ont permis le remplacement des procédures classiques dans les laboratoires de microbiologie alimentaire (Ercolini et al., 2001).

Le séquençage de l'ADNr est la technique la plus largement utilisée pour identifier les espèces microbiennes isolées à partir des aliments ou autres écosystèmes. Un certain nombre de méthodes d'identification basées sur le séquençage, ont été utilisées pour analyser les gènes de l'opéron ARNr ainsi que d'autres gènes conservés chez les bactéries. Concernant l'opéron ARNr, le gène de l’ARNr 16S est généralement amplifié pour l'identification bactérienne, tandis que les gènes de l'ARNr fongique (5.8S, 18S et 25S) et/ou les marqueurs ITS sont utilisés pour l'identification des levures et des moisissures. Une fois la séquence entière ou partielle du gène est déterminée, elle est comparée à des séquences connues de microorganismes à l'aide de logiciels spécialisés et/ou des outils en ligne (Hervé et al., 2008).

L’accumulation des informations sur les séquences d'ADNr c’est avérée efficace pour l'identification comparative des microorganismes, conduisant à la reconnaissance de milliers d'espèces microbiennes. Toutefois, les données des séquences du gène ARNr 16S ne permettent pas l'identification des espèces étroitement liées. L’utilisation des gènes de ménage

3. Les méthodes moléculaires de caractérisation Etude bibliographique

Tableau 5 : Avantages et limites de l'utilisation des principales techniques moléculaires dans l’identification et le typage microbien (Cocolin and Ercolini, 2008).

ARDRA-PCR, Amplification Ribosomal DNA Restriction Analysis-PCR; ITS-PCR, Internal Transcribed Spacer-PCR; RISA-PCR, rRNA gene Internal Spacer Analysis PCR; RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism; REA-PFGE, Restriction Endonuclease Analysis Pulsed Field Gel Electrophoresis; RAPD-PCR, Randomly Amplified Polymorphic DNA-PCR; Rep-PCR, Repetitive element sequence-based-PCR; AFLP, Adaptor Fragment Length Polymorphism.

Méthode Avantages Limites

A. Identification

- Hybridation

ADN-ADN

Haut niveau de discrimination; faciliter d'interprétation; reproductibilité élevée

Lourde ; longue; coûts élevés

- Méthodes

basées sur la PCR (e.g. ARDRA-PCR, ITS (ou RISA)-PCR)

Rapide ; reproductibilité élevée ; facile à utiliser et à interpréter ; cout faible ou modéré

Niveau de discrimination modérée

- Séquençage de

l'ADN

Haut niveau de discrimination;

meilleure précision et reproductibilité ; plates-formes automatisées disponibles ; bases de données publiques

disponibles

Haute compétence technique est nécessaire ; coûts élevés

B. Typage

Méthodes RFLP

- Ribotypage

Haut niveau de discrimination; faciliter l'interprétation ; élevé reproductibilité ;

plates-formes automatique disponibles

Lourde ; longue; coûts élevés

- REA-PFGE Excellent niveau de discrimination

; excellente reproductibilité ; facilité d'interprétation ;

bases de données publiques disponibles

Lourde ; difficile à utiliser ; longue; coûts élevés

Méthodes basées sur la PCR

- RAPD-PCR;

Rep-PCR

Haut niveau de discrimination;

rapidité ; utilisation et interprétation facile ; faibles coûts

Reproductibilité modérée ; aucune

base de données publiques disponibles

- ITS (ou

RISA)-PCR

Rapide ; utilisation et interprétation faciles ; reproductibilité élevée ; faibles coûts

Niveau de

discrimination modérée ; aucune base de données publique disponible

- AFLP Modérément facile à utiliser et

interpréter ; haut pouvoir de discrimination; reproductibilité élevée ;

plates-formes automatique disponibles

Coûts élevés ; aucune base de données publiques disponibles

3. Les méthodes moléculaires de caractérisation Etude bibliographique

tels que rpoA, rpoB, pheS et recA des bactéries, et la β-tubuline des champignons sont de plus en plus utilisés comme marqueurs phylogénétiques pour plus de résolution taxonomiques (Guarro et al., 1999; Vandamme et al., 2014).

L'introduction des techniques de biologie moléculaire a donné une variété de méthodes de typage à base d'ADN, permettant la discrimination entre les isolats d'une espèce donnée. Selon les aspects techniques, les méthodes de typage génétiques actuellement utilisés sont divisées en plusieurs catégories avec différentes résolutions taxonomiques. Le typage peut être basé sur l’amplification par PCR de régions d’ADN correspondant à des gènes connus. La RAPD (random amplified polymorphic DNA), est fondée sur l’utilisation d’amorces courtes dont la séquence est choisie au hasard. La REP-PCR (Repetitive element sequence-based-PCR) vise l’amplification de fragments à partir de séquences répétées dans le génome bactérien. Les fragment d’ADN obtenus, dans les deux méthodes, sont séparés par électrophorèse en gels d’agarose selon leurs tailles et les profils électrophorétiques sont ensuite comparés (Hervé et al., 2008). Le typage peut être également basé sur les profils de restrictions, obtenus par l’utilisation d’endonucléases de restriction qui coupent l’ADN au niveau de séquences spécifiques générant des fragments plus ou mois longs. Le nombre et la taille des fragments générés sont caractéristiques de l’isolat étudié. La séparation des fragments par électrophorèse en gel d’agarose permet de comparer les profils de restriction (Cocolin and Ercolini, 2008).

Il existe aussi des variantes de ces méthodes de typage microbien basées sur les profils d’amplification, de restriction enzymatique ou encore la combinaison des deux approches. La plupart des techniques de typage et d’identification couramment utilisées sont résumées dans le tableau (5).