Méthodes de biologie moléculaire

7.1. Plasmides

Le vecteur pCR-Blunt (Invitrogen) a été utilisé pour cloner le fragment d’ADN à extrémités franches obtenu après PCR. Ce plasmide possède un gène de résistance à la kanamycine, qui permet de sélectionner en présence de kanamycine (50µg/mL) les E. coli Top10 possédant le plasmide après transformation.

pQE30 et pQE70 (Quiagen) permettent de produire une protéine recombinante avec une queue polyhistidine en N-terminal et C-terminal respectivement. Ils possèdent tout deux un gène de résistance à l’Ampicilline.

Les plasmides sont extraits à l’aide du kit NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel) selon les instructions du fournisseur.

Ensuite, les plasmides sont contrôlés par électrophorèse en gel d’agarose 0,7% dans du tampon de migration Tris-Borate-EDTA 0,5 X (TBE : Tris-HCl 25 mM, pH 8, Acide Borique 25 mM, EDTA 0,5 mM) en présence de 0,1 µg/mL de bromure d’éthidium (BET).

7.2. Clonage moléculaire et PCR

Les protocoles classiques de biologie moléculaire utilisés dans cette partie sont décrits dans Molecular Cloning, Sambrook et Russell (2001).

7.2.1. Réactions de PCR et amorces

Les réactions de PCR ont été réalisées dans un volume final de 50 µL, en présence de 1,75 unités de Pfx (Invitrogen), de tampon Amplification Pfx 1X commercialisé avec l’enzyme, 1 mM de MgSO4, 80 µM de chacun des 4 dNTP, 0,3 µM de chacune des amorces (Tableau 5) et l’ADN de L. pneumophila.

Les amorces possèdent des sites de restriction introduits pour faciliter les clonages ultérieurs. Tableau 5 : Amorces utilisées pour réaliser la PCR

Construction Nom Nombre _{de bases (°C)} Tm _restriction Site de Séquence

Rpf Lens

Direct 34 96 BamHI CTTAGCGATTGATAC GGATCCATGATGAAACTGT His-tag en

N-Term Rpf Lens

Inverse 34 100 HindIII CGACTCCTTGAGTAAC AAGCTTATCCACGCGAAT Rpf his

dir2 26 78 SphI GGGATTG GCATGCTGAAACTGTTAGC His-tag en

C-Term Rpf his

Reverse 26 80 BglII GGCCTTG AGATCTTCCACGCGAATCT La réaction de PCR est initiée par une étape de dénaturation de 2 min à 94°C. Ensuite, le cycle PCR commence par une dénaturation à 94°C pendant 15 secondes. L’hybridation des amorces est réalisée à 55°C pendant 30 secondes et l’élongation à 68°C pendant 30 secondes. Ce cycle est répété 30 fois puis la terminaison de l’élongation est effectuée à 68°C pendant 5 min.

Les produits PCR sont purifiés à l’aide du kit NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel) selon les instructions du fournisseur et repris dans un volume final de 10 µL.

7.2.2. Ligature du produit PCR dans pCR-Blunt

La ligature est réalisée dans un volume final de 10 µL, en présence de 25 ng de pCR-Blunt, de tampon de ligature 2,5 X fourni avec le kit, de 5 µL de produit PCR purifié et de 4 unités de T4 DNA ligase. La réaction est réalisée 1 heure à 16°C comme indiqué dans le Zero Blunt PCR Cloning kit (Invitrogen). Le produit de ligature est purifié par précipitation, en présence d’acétate de sodium et d’éthanol, puis repris dans 10 µL d’EUP.

7.2.3. Clonage après digestion par les enzymes de restriction

Les vecteurs pQE30 et pQE70 (50 ng) et l’ADN exogène à cloner (500ng) sont digérés par les enzymes appropriées (BamHI/HindIII pour pQE30 ou BglII/SphI pour pQE70) 2 heures à 37°C. Les enzymes sont inactivées par chauffage à 75°C pendant 10 minutes.

Les fragments à cloner sont purifiés après migration électrophorétique sur gel d’agarose 0,7% en tampon de migration TBE 0,5 X en présence de 0,1 µg/mL de BET, à l’aide du kit NucleoSpin ExtractII (Macherey-Nagel) selon les instructions du fournisseur.

La ligature dans les vecteurs est réalisée 1 heure à 16°C à l’aide d’une T4 DNA ligase.

7.3. Transformation d’Escherichia coli

Des cellules compétentes ont été préparées par la méthode au CaCl2 (Mandel et Higa, 1970). Après transformation thermique (3 minutes à 42°C), puis un repos d’une heure en présence de LB à 37°C, les bactéries sont étalées sur gélose LB contenant 25 µg/mL de kanamycine et 100 µg/mL d’ampicilline. Les boîtes sont incubées la nuit à 37°C.

7.4. Expression des protéines recombinantes

Les colonies qui se sont développées sur le milieu LB contenant les antibiotiques sont repiquées dans des tubes de 5 mL de LB avec antibiotiques et incubées à 37°C sous agitation pendant une nuit.

2,5 mL de cette préculture d’une nuit sont ensemencés sur 50 mL de LB contenant 100 µg/mL d’ampicilline et 25 µg/mL de kanamycine dans un erlenmeyer de 250 mL. La culture est incubée à 37°C, sous agitation (environ 300 rpm), jusqu’à ce que la DO600nm soit comprise entre 0,5 et 0,7.

1 mL de culture est prélevé juste avant induction (contrôle non induit) et centrifugé à 4000 g pendant 20 min. Le surnageant est éliminé et le culot lavé avec 1 mL d’eau ultra pure stérile puis conservé à -80° C jusqu’à l’analyse.

L’expression de la protéine est induite en ajoutant de l’IPTG de façon à obtenir une concentration finale de 1mM. Les cultures sont incubées à 37°C sous agitation (environ 300 rpm) pendant 4 heures.

Après 4 heures d’incubation, différents volumes de culture sont prélevés, centrifugés et lavés avec de l’eau ultra pure stérile puis les culots sont conservés à -80°C.

7.5. Extraction et purification des protéines recombinantes

7.5.1. Extraction

Les protéines recombinantes sont extraites, à l’aide de microbilles de verre stériles (0,1- 0,25mm, Fisher Scientific) par vortexage de 2 min en présence de tampon BB-Urée (0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 8 M Urée, pH 8,0), en 3 étapes de 500 µL, 500 µL et enfin 200 µL. Après chaque vortexage, les cellules sont centrifugées 2 minutes à 10000 g. Le surnageant récupéré à chaque étape est collecté dans un même tube (environ 1,2 mL) puis ce mélange est centrifugé 15 min. à 10000g à 4°C. Le surnageant est récupéré et constitue l’Extrait Brut (EB).

Afin d’optimiser l’extraction, le même protocole a été appliqué sur d’autres échantillons en présence de 1 % ou 2 % de Tween 20 dans le tampon BB-Urée.

7.5.2. Purification

La protéine marquée par le His-tag est purifiée sur résine de Nickel.

600 µL de résine greffée par du Nickel sont mis en présence de 1 mL d’extrait brut. Ce mélange est agité par retournement 8 à 10 fois pour optimiser le contact protéine-résine puis laissé au repos 5 minutes à température ambiante avant d’être centrifugé 1 min. à 10000g. La fraction non retenue, notée E0, est conservée pour contrôle.

Lavages : 600 µL de tampon BB (0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0) sont ajoutés sur la résine. Le mélange est homogénéisé par retournement et centrifugé 1 min. à 10000 g. La fraction non retenue, notée EBB, est conservée. Cette étape est répétée deux fois (soit 1,2 mL

600 µL de tampon WB (0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 60 mM imidazole, pH 8,0) sont ajoutés sur la résine. Le mélange est homogénéisé par retournement et centrifugé 1 min. à 10000 g. La fraction non retenue, notée EWB, est conservée. Cette étape est répétée deux fois

(soit 1,2 mL de EWB récupéré).

Elution : 600 µL de tampon EL (0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 500 mM imidazole, pH 8,0) sont ajoutés sur la résine. Le mélange est homogénéisé par retournement et centrifugé 1 min. à 10000 g. Cette étape est répétée trois fois et les fractions non retenues, notées EP, (soit 1800 µL) sont collectées dans un même tube.

7.5.3. Vérification des protéines induites par SDS-PAGE

Chaque fraction récupérée lors de la purification est déposée sur gels SDS-PAGE (Annexe 5) et l’électrophorèse est réalisée à l’aide du Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System (Biorad) à 65mA pendant 10min suivi de à 48mA jusqu'à ce que le bleu de bromophénol sorte du gel.

Après migration, les gels SDS-PAGE sont placés dans un bain de fixation (mélange Méthanol/Acide Acétique/EUP : 40/10/50) pendant 1 heure afin de fixer les protéines dans les gels. Les gels sont ensuite placés dans un bain de solution de coloration au bleu de Coomassie colloïdal (Annexe 6) pendant une nuit, rincés avec de l’eau ultra pure puis scannés à l’aide du système GS-710 Calibrated Imaging densitometre (Biorad).

7.5.4. Test de réveil de L. pneumophila par les protéines

recombinantes

En nous basant sur les travaux de Pantdapom et al., 2006 réalisés sur Salmonella, nous avons testé les protéines recombinantes Rpf que nous avons obtenues sur des suspensions de L.

pneumophila à 109 bactéries/mL devenues non cultivables suite à un traitement à 57,5°C ou à une incubation prolongées (3 mois) dans un milieu pauvre (BYE dilué au millième) à 25°C mais possédant une membrane intègre (BacLight).

Nous avons réalisé les tests dans du BYE 5%. Pour cela, nous avons mis en présence 50 µL de BYE 10%, 50 µL de suspension bactérienne à 109 _{cellules/mL et 10 µL de protéine} purifiée.

Des tests ont également été réalisés en ajoutant 10 µL d’extrait brut induit et non induit. Les tubes ont ensuite été placés à 37°C, 5% CO2 pendant 3 jours.

CHAPITRE 3 :