Analyse de l’état VBNC

A notre connaissance, aucun travaux portant sur une analyse moléculaire approfondie de l’état VBNC chez Legionella n’est à l’heure actuelle disponible dans la littérature.

Cependant, ce type d’analyse a été entrepris pour l’étude de l’état VBNC chez d’autres bactéries, telles que Enterococcus feacalis, Vibrio cholerae, Escherichia coli O157 :H7,

Lactobacillus, en utilisant une approche protéomique ou transcriptomique (Asakura et al.,

Heim et al. (2002) ont étudié les variations du protéome chez E. faecalis à l’état VBNC après une incubation de 20 jours dans de l’eau de lac à 4°C. Ils ont montré que les bactéries en carence nutritionnelle mais cultivables et à l’état VBNC présentaient des profils différents. Ces profils différaient également de celui des bactéries en phase exponentielle de croissance.

Dans cette étude, une analyse protéomique partielle a montré une diminution de la quantité de certaines protéines importantes durant l’état VBNC :

- deux protéines de stress, GroEL et DnaK ;

- la fructose biphosphate aldolase, protéine clé dans la voie de la glycolyse, l’enolase (glycolyse), l’ATP synthase (phosphorylation oxydative) et l’enoyl-ACP reductase (biosynthèse des phospholipides), une protéine homologue au système mannose-specific phosphotransferase (PTS) de Clostridium acetobutylicum, le facteur d’élongation EF-Tu, impliqué dans la synthèse protéique, la régulation de la croissance et la réponse au stress ce qui semble être en accord avec la diminution de l’activité métabolique observée durant l’état VBNC ;

En revanche, l’accumulation de la quantité de trois protéines est observée dans les cellules à l’état VBNC :

- une protéine homologue du facteur d’élongation factor Ts (EF-Ts) de Listeria

innocua,

- une protéine homologue de la fructose-bisphosphate aldolase de Streptococcus

pneumoniae,

- une protéine régulatrice de catabolites (putative catabolite regulator protein CRP, CAA09491).

L’analyse de l’expression de ces trois protéines par RT-PCR (Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction) a montré qu’elles étaient exprimées dans cet état pendant au moins 14 jours.

Une autre protéine (30 kDa, pI = 6) est observée seulement chez les cellules à l’état VBNC. Cette protéine n’a pas pu être identifiée mais il est possible qu’elle corresponde à une forme modifiée de l’enoyl-ACP reductase, cette hypothèse provenant de la comparaison des gels 2D obtenus à partir de différents états cellulaires.

La comparaison des profils 2D obtenus à partir des différents états cellulaires (carence nutritionnelle, VBNC et phase exponentielle) montre une certaine spécificité pour l’état VBNC. L’enoyl-ACP reductase est réprimée dans l’état VBNC mais aussi en carence

nutritionnelle, ce qui n’est pas le cas du facteur d’élongation EF-Ts, de la fructose biphosphate aldolase et de la mannose-specific PTS dont la variation de synthèse (amplification ou réduction) semble spécifique de l’état VBNC.

Pour Escherichia coli O157 :H7, une perte totale de cultivabilité est observée après 48 heures d’incubation dans du tampon phosphate (PBS) contenant 0,05 % de peroxyde d’hydrogène (H2O2), alors que 11 % de la population possèdent encore une intégrité membranaire. Une incubation de 72 heure conduit à une réduction importante du nombre de cellules à membrane intègre (0,4 %) (Asakura et al., 2007b). Le facteur d’élongation EF-Tu, qui était sous-exprimé chez E. faecalis (Heim et al., 2002), voit son expression maintenue chez E. coli. Ceci laisse supposer un maintien de la synthèse protéique chez cette bactérie (Asakura et al., 2007b). Une accumulation importante de la quantité d’une protéine de la membrane externe, OmpW, a été observée dans l’état VBNC. Cette protéine, bien que possédant une fonction inconnue, pourrait être une protéine de réponse à l’oxydation par le H2O2.

Une accumulation de la quantité d’homosérine kinase (ThrB), impliquée dans la biosynthèse de la thréonine, est également observée à l’état VBNC.

Parmi les protéines dont la synthèse est diminuée après 48 heures d’incubation dans l’H2O2, on retrouve des facteurs de réponse au stress oxydatif : l’Alkyl hydroperoxide reductase (AhpCF) et la Dihydrolipoyllysine-residue Acetyltransferase (AceF).

L’analyse transcriptomique de Vibrio vulnificus à l’état VBNC suite à un stress à 4°C dans une eau de mer artificielle pendant 70 jours, a permis de mettre en évidence l’induction et la répression de centaines de gènes par rapport aux cellules en phase stationnaire (Asakura

et al., 2007a). Ces gènes ont été classés suivant leur fonction : Synthèse protéique,

métabolisme énergétique, enveloppe cellulaire, processus cellulaires, fonction régulatrice, synthèse d’acides aminés, protéines de transport,…

Parmi les gènes sur exprimés à l’état VBNC, on retrouve des gènes codants pour :

- des protéines de transport de métaux : fer, magnésium, potassium et cobalamine

(vitamine B12)

- des protéines impliquées dans la chimiotaxie (qui est le mouvement des cellules

vers ou loin d'une substance en réponse à son gradient de concentration : ceci est important pour la recherche de la nourriture, fuir les toxiques, …)

- des protéines associées au flagelle (flaC : qui code pour un composant intervenant

dans l’assemblage du filament, fliG codant pour une protéine moteur) alors que le gène fliN codant pour une protéine impliquée dans la rotation du flagelle et nécessaire pour la formation du crochet est sous exprimé dans cet état

- protéines associées à l’enveloppe : PilQ impliquée dans l’assemblage du pili de

type IV, la lipoprotéine NlpL, une « outer membran protein »de transport de nitrate/sulfonate/bicarbonate de type-ABC et une UDP-glucose-6-dehydrogénase - une chitinase jouant un rôle majeur dans l’utilisation de la chitine par la bactérie

Nous pouvons constater, au regard des résultats obtenus, que les protéines dont la synthèse est augmentée à l’état VBNC chez ces différentes bactéries semblent différentes. L’état VBNC étant obtenu dans des conditions différentes, il est possible que l’expression du protéome ou du transcriptome des bactéries soit fonction des conditions conduisant à l’état VBNC, du temps passé dans cet état ou encore de l’espèce bactérienne.

Figure 5 : Alignement partiel de séquences en acides aminés de Rpfs chez les mycobactéries. (Zhu et al., 2003) (MluZ96935 est la Rpf de M. luteus ; Rv0867c, Rv1009, Rv1884c, Rv2450c sont des protéines de M. tuberculosis ; ML0240 and ML2030, de M. leprae ; Av27 de M. avium contig27 ; Mptb de M. avium subsp. paratuberculosis contig1289 ; MS3310 et MS3312 de M. smegmatis. Les cadres en grisé indiquent des résidus identiques et les lettres encadrées des résidus similaires).

3. UN NOUVEAU FACTEUR DE RESSUCITATION :