Méthodes d’analyses mises en œuvre :

La procédure d’analyse des échantillons comprend deux étapes:

- Procédure d’analyse initiale : C’est la présence d’une substance interdite ou d’un de

ses métabolites ou marqueur qui est recherchée dans cette étape.

Pour cela, des tests immunochimiques mettant en jeu la formation d’un complexe antigène-anticorps (Ag-AC) sont utilisés. Généralement, les anticorps sont spécifiques d’une classe pharmacologique et non d’une molécule. C’est pourquoi la procédure de confirmation est indispensable [100].

- L’étape confirmation : doit permettre l’identification sans ambiguïté de la substance

Les tests de dépistage peuvent être classés en deux grandes familles: 3.1 Les tests directs :

Permettent directement de valider ou non la présence de telle ou telle substance généralement dans des délais très courts.

a) Les immunodosages :

Ces techniques se limitent aux procédures de « screening » c’est-à-dire à la première phase de détection non spécifique. Cette méthode met à profit la réaction antigène / anticorps, soit par compétition, soit par une méthode dite « sandwich » où les deux extrémités de la chaine sont reconnues par les anticorps, l’antigène étant constitué par l’analyte à doser ou à détecter. Différents anticorps peuvent être mis en jeu : les anticorps monoclonaux (plus spécifiques) et les anticorps poly clonaux. La visualisation peut être faite par la mesure de radioéléments (radio-immuno-essais) ou par la mesure d’activité enzymatique (ELISA, par exemple) [102].

Un anticorps (en vert) est spécifique de l’antigène (en rouge) tandis que l’autre anticorps, couplé à une enzyme, (en jaune et mauve) réagit aux complexes immuns (antigène anticorps).

Cet anticorps secondaire peut ainsi induire un signal comme une réaction colorée grâce à l’ajout du substrat de cette enzyme. Cette dernière est alors facilement identifiable et quantifiable si nécessaire par mesure colorimétrique. Elle est la preuve de la présence dans l’échantillon de la molécule à tester [103].

Malgré tout, ces méthodes connaissent des limites, notamment en ce qui concerne leur application sur des matrices urinaires complexes qui peuvent occasionner des croisements non spécifiques risquant d’engendrer des réponses faussement positives si certaines précautions analytiques ne sont pas observées [101].

b) Les méthodes physicochimiques :

Les techniques de couplage chromatographie en phase gazeuse -spectrométrie de masse (CPG-SM) permettent d’analyser sans procédure de purification préalable, les matrices biologiques complexes.

Tous les analyseurs physico-chimiques employés sont équipés d’injecteurs automatiques et de stations informatiques de données acquises [104].

Après un temps de rétention (temps réalisé par la molécule en traversant la colonne), les composés seront détectés et un pic chromatographique apparait sur l’enregistreur, formant un chromatogramme.

Figure 12: Schéma d’un chromatographe en phase gazeuse [105].

1 : injecteur

2 : colonne contenue dans une enceinte thermostatée (four) 3 : détecteur

4 : intégrateur ou un ordinateur sur lequel apparaît le

Le couplage de la chromatographie liquide à la spectrométrie de masse a pu être réalisé avec efficacité [102]. Ainsi, la chromatographie liquide haute performance (HPLC) permet l’analyse de molécules peu volatiles ou thermosensibles c'est à dire dégradées lors de hautes températures, à l’inverse de la CPG qui ne convient pas pour les composés thermolabiles (qui se décomposent à chaud), les composés peu volatils et les composés peu ionisés [104].

Ces performances sont obtenues grâce au développement de nouveaux modes d’ionisation comme l’electrospray (figure15), ou l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) (figure 16) qui permettent la création d’ions multichargés et par un transfert optimum vers le filtre de masse, d’aborder la détermination qualitative et quantitative de molécules de très haut poids moléculaire (> 10000Da) [101].

Figure 16: Ionisation par impact électronique [108]. P1 P0 B P2 P3 P4 P5 TiC Anode repousseur

chambre d 'ionisation _{plaques accélératrices}

mesure du courant ionique Fentes réglables Cathode

Figure 15: Source d’ionisation électrospray [107]. Cône de Taylor

Cône de nébulisation Haute tension

La spectrométrie de masse est une technique de détection extrêmement sensible qui permet de déterminer les structures moléculaires. De plus, le spectromètre de masse est souvent couplé à une méthode de chromatographie et, ainsi, cette association entre une méthode séparative et une méthode d’identification permet d’analyser les substances présentes dans l’échantillon même lors de mélanges complexes [109].

Les tests directs sont spécifiques de chaque substance et ils ont une très forte sélectivité, ce qui peut devenir un handicap en cas multitude de produits existant sur le marché et implique une multitude de tests pour pouvoir vérifier l'ensemble des produits existants. Les méthodes directes ne sont applicables que dans une courte fenêtre temporelle car les substances dopantes ayant une demi-vie courte sont rapidement éliminées par métabolisme hépatique ou rénale. Ainsi, il devient très difficile de dire pour des substances comme les hormones dont les concentrations sont extrêmement faibles s’il y a eu ou non consommation de substance dopante [38].

3.2 Les tests indirects :

Ils permettent la détection de produit dopant via l'analyse de la concentration de certains marqueurs fluctuant lors de la consommation de produit.

Suivi des traceurs :

C’est un moyen qui consiste à apprécier l’incidence des substances dopantes sur différents paramètres biologiques. Cette méthode est limitée, car le profil « basal » d’un individu au repos peut être influencé par le type et l’intensité des entrainements ou l’état de fatigue du sujet. De plus, le profil établi sur des prélèvements réalisés à l’issue de compétitions est susceptible d’être modifié par divers paramètres psychologiques [101].

Par contre, ces techniques de dépistage indirect présentent un énorme avantage de mettre en avant la prise de produits même s’ils ont une demi-vie courte [38].