Méthodes d’analyse des trajectoires aMD

6.2.2.1 RMSD et Fluctuations RMS

Les déviations RMS au cours du temps ainsi que les fluctuations RMS par résidu ont été obtenues en alignant les atomes du squelette peptidique appartenant aux régions structurales les plus stables d’après les données expérimentales HDX, c’est-à-dire le sandwich d’hélices – composé de H1 (résidus 235 à 240), partie C-terminal de H3 (279 à 285), H5 (303 à 313), H7 (349 à 351), H8 (371 à 375), H9 (391 à 400) et H10 (416 à 425) du LBD de RXR–. La déviation RMS ainsi que la fluctuations RMS ont été calculées à l’aide du module Python MDAnalysis [Michaud-Agrawal et al., 2011].

6.2.2.2 Structure secondaire

La structure secondaire a été obtenue à l’aide de DSSP [Kabsch and Sander, 1983]. Les conformations ont été extraites toutes les 10 picosecondes à partir des trajectoires aMD de la forme libre phosphorylée pSer260 du LBD de RXR–. Ce sont au total 90.000 conformations qui ont été analysées.

CHAPITRE 6. EFFET DE LA PHOSPHORYLATION PSER260 175 6.2.2.3 Déplacements chimiques RMN

Les déplacements chimiques RMN ont été prédits en utilisant le programme SHIFTX+ issu de SHIFTX2 en utilisant un pH égal à 7.4 et une température égale de 298.15 K [Han et al., 2011]. Les conformations ont été extraites toutes les 10 picosecondes à partir des trajectoires aMD de la forme libre phosphorylée pSer260 du LBD de RXR–. Au total, ce sont 90.000 conformations qui ont été analysées.

L’ensemble des scripts Python ayant été utilisés pour calculer les déplacements chimiques à partir des conformations extraites des trajectoires MD, ainsi que pour comparer les déplacements chimiques prédits

”predaux déplacements chimiques expérimentaux ”expsont disponibles librement sous licence MIT à cette adresse : https://github.com/jeeberhardt/shift

6.2.2.4 Échange Hydrogène/Deutérium

L’échange Hydrogène/Deutérium a été calculé à partir des constantes de vitesses intrinsèques kintpar proton amide HN obtenues à l’aide du modèle empirique développé par Bai et al. [Bai et al., 1993], ainsi qu’à partir des facteurs de protection PF de chaque proton amide HN obtenu à partir des trajectoires aMD de la forme libre phosphorylée pSer260 du LBD de RXR–. Les facteurs de protections PF ont été obtenus du nombre de liaisons hydrogène établies entre chaque proton HN et le solvant selon le modèle simple et le modèle concerté, à l’aide du module python MDAnalysis [Michaud-Agrawal et al., 2011]. Au total, ce sont 900.000 conformations qui ont été analysées.

L’ensemble des scripts Python pour déterminer les facteurs de protection P F à partir des trajectoires MD ainsi que prédire l’incorporation en deutérium au cours du temps est disponible librement sous licence MIT à cette adresse : https://github.com/jeeberhardt/hdx

6.2.2.5 Stochastic Proximity Embedding

Un très grand nombre de conformations ont été générées durant les simulations aMD de la forme libre phosphorylée pSer260 du LBD de RXR–, avec au total 9 105 conformations. Il a été ainsi nécessaire de les organiser afin de pouvoir analyser l’espace conformationnel échantillonné. Pour cela, nous avons utilisé l’algorithme pSPE qui est une méthode non linéaire de réduction de la dimensionnalité des données, en utilisant la distance dihédrale comme métrique, au lieu du RMSD (voir chapitre 3 pour plus de détails).

Ainsi, tous les pseudo angles dièdres entre 4 C– consécutifs ont été extraits de chaque conformation présente dans les trajectoires aMD à l’aide du module Python MDAnalysis [Michaud-Agrawal et al., 2011]. Au total, 235 pseudo angles dièdres ont été extraits pour la forme libre phosphorylée pSer260 du LBD de

CHAPITRE 6. EFFET DE LA PHOSPHORYLATION PSER260 176 RXR–, respectivement. Ainsi que détaillé dans le chapitre 3, la méthode pSPE utilise le paramètre rc, rayon

de proximité utilisé pour déterminer la région où la distance euclidienne est une bonne approximation (cu- toff ) de la distance géodésique. Il n’existe pas de règle permettant de fixer à priori la valeur du paramètre

rcmenant à la meilleure réduction de dimensionnalité. L’approche empirique que nous avons implémentée

(voir Chapitre 3) est de tester, systématiquement les valeurs de rc entre 0.1 et 0.5 par intervalles de 0.01.

Ces tests sont effectués sur 10 000 structures extraites des trajectoires, pour un nombre fixe (5000) de cycles d’optimisation, et ils sont répétés cinq fois pour chaque valeur du paramètre rc. L’examen de l’évolution

du stress, et de la corrélation “ calculés pour chaque valeur de rc (voir Chapitre 3) permet de déterminer

empiriquement la valeur de rcqui offre le meilleur compromis entre une valeur maximale de la corrélation “ et minimale du stress. Une fois la valeur optimale de rcdéterminée de cette manière, un certain nombre

de tests supplémentaires sont réalisés afin d’assurer de la robustesse de la procédure. Ainsi, le nombre de cycles d’optimisation C est systématiquement modifié, de 10 cycles à 100 000 cycles (valeurs intermé- diaires : 50, 100, 500, 1000, 5000, 10 000, 50 000) et ce pour des nombres différents de conformations (10 000, 50 000 et 100 000). Chacun de ces tests est répété cinq fois vu le caractère stochastique de l’algo- rithme pSPE. Ceci nous permet d’estimer le nombre minimal de cycles d’optimisation C nécessaire pour obtenir la meilleure réduction de dimensionnalité, avec le rc choisi. L’utilisation de différents échantillons

de conformations permet également de tester la stabilité et la vitesse de convergence de la méthode. Une fois l’ensemble de ces tests réalisés, la méthode est appliquée sur l’ensemble des 900 000 conformations.

L’ensemble des scripts Python pour extraire les angles dièdres à partir de trajectoires MD, déterminer les valeurs optimales des paramètres rc et C, ainsi que la méthode pSPE sont disponibles librement sous

licence MIT à cette adresse : https://github.com/jeeberhardt/unrolr

6.2.2.6 Repondération de l’énergie des trajectoires aMD

Afin de repondérer l’énergie des conformations issues des trajectoires aMD de la forme phosphorylée, nous avons effectué une analyse similaire à celle réalisée sur les trajectoires aMD de la forme libre non phosphorylée. Des coordonnées collectives ont été obtenues à l’aide de la méthode pSPE, puis utilisées dans la repondération des conformations, en repondérant avec la série de McLaurin d’ordre 10 avec une température de 298.15 K et un intervalle (bin size) de 0.05.

L’ensemble des scripts Python ayant servi à repondérer l’énergie des trajectoires aMD sont aussi disponibles librement sous licence MIT à cette adresse : https://github.com/jeeberhardt/ reweight

CHAPITRE 6. EFFET DE LA PHOSPHORYLATION PSER260 177 6.2.2.7 Visualisation des conformations

Pour permettre de visualiser l’espace conformationnel échantillonné durant les simulations, le module Python Bokeh [Bokeh Development Team, 2014] et PyMOL [Schrödinger, LLC, 2015] ont été utilisés. Ainsi, à partir de variables collectives quelconques, provenant soit de la méthode pSPE ou depuis n’importe quelle méthode d’apprentissage automatique, telle que la PCA, il est possible de visualiser les conforma- tions générées. De même, l’ensemble des scripts Python sont disponibles librement sous licence MIT à cette adresse : https://github.com/jeeberhardt/visualize

6.3 Résultats

6.3.1 Analyse des trajectoires aMD

6.3.1.1 RMSD global

Le RMSD global de la forme phosphorylée pSer260 augmente rapidement dès le début des simulations aMD, ce qui est cohérent avec le comportement de la forme libre du LBD de RXR– non phosphorylée (Figure 6.1).

FIGURE 6.1 – RMSD global du squelette peptidique au cours du temps, calculé pour chaque trajectoire

aMD de la forme libre phosphorylée pSer260 du LBD de RXR–. Le RMSD a été calculé en alignant toutes les structures issues des trajectoires aMD sur la structure cristallographique de référence (PDB id : 1LBD) en ne considérant que la partie la plus stable, c’est-à-dire le sandwich d’hélices – composé de H1 (résidus 235 à 240), partie C-terminal de H3 (279 à 285), H5 (303 à 313), H7 (349 à 351), H8 (371 à 375), H9 (391 à 400) et H10 (416 à 425). En haut, le RMSD de l’ensemble du domaine au cours du temps et en bas, le RMSD du sandwich d’hélices – seul.

Le RMSD global oscille entre 4 et 10Å, par rapport à la structure cristallographique non phosphorylée de référence, selon les trajectoires aMD. En ce qui concerne le sandwich d’hélices –, le RMSD global

CHAPITRE 6. EFFET DE LA PHOSPHORYLATION PSER260 178 oscille aussi aux alentours de 2.5Å au cours du temps, excepté pour quelques trajectoires aMD où l’on observe des pics à 4Å (Figure 6.1).

6.3.1.2 Fluctuation RMS

Quant aux fluctuations RMS par résidu, obtenues à partir des trajectoires aMD de la forme phospho- rylée du LBD de RXR–, elles montrent que les régions fluctuant le plus sont les mêmes que dans les trajectoires de la forme non phosphorylée (Figure 6.2).

FIGURE6.2 – Fluctuations RMS par résidu du squelette peptidique, moyennées sur l’ensemble des trajec-

toires aMD (en haut) ainsi que le détail par trajectoire aMD (en bas) de la forme libre phosphorylée pSer260 du LBD de RXR–. En jaune, les fluctuations RMS par résidu de la forme libre phosphorylée pSer260, en bleu les fluctuations de la forme libre non phosphorylée et en noir les fluctuations RMS calculées à partir des facteurs B de la structure cristallographique de référence de la forme libre du LBD de RXR– (PDB id : 1LBD).

Nous retrouvons la région N-terminale, la boucle entre H1 et H3 ainsi que la moitié de H3 du côté N-terminal, la boucle entre H3 et H4, H4 comprise, la région du feuillet — et H6, les boucles H8 et H9

CHAPITRE 6. EFFET DE LA PHOSPHORYLATION PSER260 179 avec la partie N-terminale de H9, la boucle H9-H10 et pour finir toute la partie C-terminale avec H12 com- prise. Globalement, l’examen des fluctuations RMS indique que l’ensemble conformationnel exploré par les trajectoires aMD dans la forme phosphorylée diffère de celui exploré dans la forme libre non phospho- rylée. Certaines différences se reproduisent sur un ensemble de trajectoires, et mènent à des fluctuations plus importantes (région allant du C-terminal de H3 au C-terminal de H4) ou moins importants (partie C-terminale de H5 et région du feuillet —) dans la forme phosphorylée que dans la forme libre non phos- phorylée. Cependant, vu la nature modifiée de la surface d’énergie potentielle explorée lors des trajectoires aMD, des analyses complémentaires seront nécessaires pour conclure de manière définitive sur l’effet de la phosphorylation sur l’amplitude des fluctuations.

6.3.1.3 Structure secondaire

L’analyse de la structure secondaire à l’aide de DSSP des trajectoires aMD de la forme libre pSer260 du LBD de RXR– montre de même que la structure secondaire est elle aussi globalement conservée. Les hélices qui composent le sandwich d’hélices – restent en hélice plus de 80 % du temps au cours des trajectoires aMD, de même que le feuillet — (Figure 6.3).

FIGURE6.3 – Proportion de la structure secondaire (en %) par résidu, calculé à l’aide de DSSP à partir des

trajectoires aMD de la forme libre phosphorylée pSer260 du LBD de RXR–. En bleu sont représentés les résidus en hélice (–, fi et 310) et en jaune les résidus formant un feuillet ou un pont —.

Cependant, on remarque tout de même une légère déstructuration au niveau de H1 et de H10. Concer- nant le reste du domaine, d’importantes différences sont observées dans la boucle H1-H3 et au niveau de