Immunophénotypage des lymphocytes tumoraux par double
marquage CD19/CD5
L’étude de la coexpression CD19/CD5 est réalisée sur sang total avec un anticorps
anti-CD19 couplé à l’isothiocyanate de fluorescéine et un anticorps anti-CD5 couplé à la
phycoérythrine.
Cinquante µ L de sang périphérique de patients atteints de LLC-B ont été incubés 30
minutes à 4°C avec 5 µ L du mélange d’anticorps monoclonaux d’intérêt. Les globules rouges
ont ensuite été lysés grâce à la station de travail Coulter Q-Prep. Ce système présente l’avantage
de permettre la lyse des érythrocytes et la fixation des leucocytes en trois étapes parfaitement
chronométrées. Il s’agit d’un système automatisé qui permet l’addition séquentielle :
d’acide formique (1.2 mg/L) jouant le rôle d’agent de lyse.
de carbonate de sodium (6 g/L) / chlorure de sodium (14.5 g/L) / sulfate de sodium
(31.3 g/L) : cette solution tampon joue le rôle de stabilisateur et neutralise la lyse
formique.
de paraformaldéhyde (10 g/L) qui permet de fixer les cellules.
Les échantillons ont ensuite été conservés à 4°C à l’obscurité avant d’être analysés par
cytométrie de flux.
Les données ont été analysées à l’aide des histogrammes suivants :
un histogramme biparamétrique Structure/Taille qui donne accès à des
informations sur la taille et la morphologie de la cellule. Sur ce cytogramme ou
scattergramme, chaque cellule est représentée par un point dont les coordonnées
indiquent la granularité cellulaire en abscisse et la taille de la cellule en ordonnée. La
corrélation de ces deux paramètres permet de différencier les 3 sous-populations
leucocytaires (lymphocytes, monocytes et granulocytes) qui apparaissent sous forme
de nuages de points autour desquels sont définies des fenêtres d’intérêt. Les
polynucléaires ont une granulosité supérieure à celle des monocytes pour une taille
quasiment équivalente. Les lymphocytes ont une taille et une granularité inférieure à
celles des deux autres populations leucocytaires. Les signaux indésirables tels que
les débris cellulaires peuvent être détectés et exclus de l’analyse sur leurs critères de
petite taille et faible granularité. De la même façon, les agrégats situés très haut dans
la partie supérieure de l’écran peuvent être exclus de la région à étudier. Une fenêtre
d’intérêt (ou Bitmap) a été placée au niveau de chacune des 3 sous-populations.
Seules les cellules contenues dans la Bitmap "lymphocytes" ont été étudiées dans la
suite des analyses.
un histogramme biparamétrique FITC/PE : cet histogramme permet de
différencier, au niveau des lymphocytes, les populations cellulaires marquées en
FITC (FL1) (quadrant AI4), en PE (FL2) (quadrant AI1) ou à la fois en FITC et PE
(quadrant AI2), ce qui correspond aux cellules exprimant à la fois CD19 et CD5.
Un exemple de l’ensemble de ces histogrammes est présenté dans la figure 15.
Figure 15 : Exemple d’histogrammes biparamétriques utilisés pour l’immunophénotypage
des lymphocytes B tumoraux par double marquage CD19/CD5
Les valeurs relevées étaient le pourcentage de lymphocytes marqués pour chaque molécule d’intérêt et la
moyenne d’intensité de fluorescence de chacune des populations simplement marquée, doublement
marquée ou non marquée, caractéristique de la densité antigénique de chaque marqueur sur les cellules.
STRUCTURE T A IL L E CD19-PE C D 5 -F IT C
Immunophénotypage des lymphocytes T par quadruple
marquage (CD45/CD3/CD4/CD8)
L’immunophénotypage des lymphocytes T a été réalisé selon une stratégie similaire à
l’aide d’un mélange d’anticorps monoclonaux conjugués à des fluorochromes différents.
Les histogrammes suivants ont été générés pour chaque prélèvement étudié :
un histogramme biparamétrique CD45/Taille qui exprime la taille des cellules en
fonction du logarithme de l’intensité de fluorescence CD45-FITC. Cet histogramme
permet de repérer et d’analyser les lymphocytes qui sont les leucocytes exprimant le
plus fortement cette molécule en définissant les contours d’une Bitmap appelée
Bitmap A. Seules les cellules contenues dans cette Bitmap ont été étudiées dans la
suite des analyses.
un histogramme monoparamétrique CD3/count permettant de comptabiliser le
nombre de cellules exprimant le marqueur CD3-PC5 au sein des lymphocytes de la
Bitmap A.
un histogramme biparamétrique CD3/CD8 permettant de déterminer le
pourcentage de cellules exprimant le marqueur CD3 (quadrant J4), le marqueur
CD8-ECD (quadrant J1) et les cellules doublement marquées exprimant à la fois les
marqueurs CD3 et CD8 (quadrant J2).
un histogramme biparamétrique CD3/CD4 permettant de déterminer le
pourcentage de cellules exprimant le marqueur CD3 (cadre I4), le marqueur
CD4-RD1 (quadrant I1) et les cellules doublement marquées exprimant à la fois les
marqueurs CD3 et CD4 (quadrant I2).
Figure 16 : Exemple d’histogrammes monoparamétrique et biparamétriques utilisés pour
l’immunophénotypage des lymphocytes T par quadruple marquage
Immunophénotypage des lymphocytes tumoraux par simple
marquage
Pour les marquages indirects réalisés avec des anticorps monoclonaux non conjugués à
un fluorochrome (CD20, CD22, CD23, CD79β, CD14, CD13 et CD33), 50 µ L de suspension
cellulaire obtenue après isolement des PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells) ont
d’abord été incubés avec 5 µL d’un anticorps primaire non-conjugué dirigé contre la molécule
étudiée. Après lavage avec 1 mL de solution de rinçage constituée de Hank’s supplémenté
avec 0.1% de SVF, les échantillons ont été centrifugés 5 minutes à 600 g puis incubés avec 10
µ L d’une solution contenant un anticorps secondaire de lapin anti-immunoglobulines de
souris conjugué au FITC. Un rinçage a été à nouveau effectué et 300 µ L de paraformaldéhyde
1% en PBS ont été ajoutés au culot cellulaire afin de fixer les cellules. Les cellules ont été
CD3-PC5 CD3-PC5 C D 8 -E C D C D 4-PE CD45-FITC S T R U C T U R E CD3-PC5
conservées à 4°C jusqu’à leur analyse en cytométrie de flux.
Pour l’étude des marqueurs directement conjugués (anti-FMC7-FITC, anti-CD79β-FITC
et chaînes lourdes et légères des immunoglobulines), 50 µ L d’une suspension cellulaire
lymphocytaire isolée à partir du sang périphérique ont été incubés 30 minutes à 4°C dans
l’obscurité en présence des anticorps conjugués à l’isothiocyanate de fluorescéine. Les
cellules ont ensuite été lavées avec 1 mL de solution de rinçage et fixées avec 300 µ L de
paraformaldéhyde 1% en PBS puis conservées à 4°C jusqu’à leur analyse en cytométrie de
flux.
Pour chaque prélèvement étudié, les données ont été analysées à l’aide des
histogrammes suivants (figure 17) :
un histogramme biparamétrique Structure/Taille permettant d’identifier les
populations cellulaires analysées et de placer la fenêtre d’intérêt englobant la
population lymphocytaire.
un histogramme monoparamétrique FITC/Count : il permet d’analyser la
répartition de l’intensité de fluorescence dans la population cellulaire comprise dans
la Bitmap retenue. Grâce à des curseurs d’intégration, il est possible de définir des
sous-groupes pour lesquels sont calculés le pourcentage de cellules marquées et
l’intensité de fluorescence moyenne.
Figure 17 : Exemple d’histogrammes biparamétrique et monoparamétrique utilisés pour
l’immunophénotypage des cellules de LLC-B par simple marquage direct et
indirect.
C STRUCTURE T A IL L E FITC C STRUCTURE T A IL L E FITC
Dans le document
Expression et fonctionnalité des Toll-Like récepteurs par les cellules de leucémie lymphoïde chronique B
(Page 100-105)