Les cellules mononuclées issues de concentrés leuco-plaquettaires ont été marquées au
CFSE comme décrit dans le paragraphe VII.2. Cent µL de cellules mononuclées marquées ont
été ensuite remises en suspension dans du milieu de culture complet dans du RPMI 1640
supplémenté avec 5% de SVF, 1% de tampon Hepes, 1% d’antibiotiques à la concentration de
2x10
6cellules/mL. Cette suspension cellulaire a été répartie à raison de 100 µ L/puits dans des
plaques de culture de 96 puits à fond rond. Ces cellules correspondaient aux cellules
répondantes. Cent µ L de suspensions cellulaires d’amygdales palatines ou de LLC-B
stimulées ou non avec le PMA et les ODN CpG ont été ajoutés à des doses graduelles pour
stimuler les cellules répondantes (ratio lymphocytes B/lymphocytes T de 1/1, 1/3, 1/10, 1/30
et 1/100). Un contrôle négatif de prolifération spontanée des cellules et un contrôle positif de
stimulation ont également été réalisés en ajoutant respectivement aux cellules répondantes
100 µ L de milieu de culture seul et 100 µ L de milieu de culture additionné de
phytohemagglutinine-L (PHA-L) à la concentration de 5 mg/mL. La PHA-L est une lectine
d’origine végétale qui stimule les lymphocytes T. Trois réplicats ont été réalisés pour chaque
mesure. Les suspensions cellulaires ont été incubées à 37°C dans une atmosphère contenant
5% de CO
2et 95% d’humidité.
A J6, les cellules ont été recueillies, lavées avec du PBS 1x, puis incubées avec un
anticorps anti-CD3-ECD, un anticorps anti-CD4-PC5, et un anticorps anti-CD8-PC7 pendant
15 minutes à température ambiante. Après marquage, les cellules ont à nouveau été lavées
avec du PBS 1x puis fixées avec 300 µ L de paraformaldéhyde et conservées à 4°C jusqu’à
analyse par cytométrie de flux.
Les données ont été analysées à l’aide des histogrammes suivants (figure 29) :
un histogramme biparamétrique Structure/Taille : cet histogramme permet de
placer la fenêtre d’intérêt au niveau des lymphocytes.
un histogramme biparamétrique CD3-ECD/Structure qui permet de repérer les
cellules fluorescentes marquées au CD3-ECD et de placer la fenêtre d’intérêt
englobant les lymphocytes CD3+.
un histogramme monoparamétrique CFSE/Count : il permet d’analyser la
répartition de l’intensité de fluorescence du CFSE parmi les lymphocytes exprimant
le marqueur CD3.
un histogramme biparamétrique CD3-ECD/CD4-PC5 qui permet de distinguer,
parmi les lymphocytes de la fenêtre d’intérêt, les cellules doublement marquées
exprimant à la fois CD3 et CD4 (J2). Il permet de placer une Bitmap au niveau des
lymphocytes CD3+ CD4+.
un histogramme monoparamétrique CFSE/Count : il permet d’analyser la
répartition de l’intensité de fluorescence du CFSE parmi les lymphocytes CD3+
CD4+
un histogramme biparamétrique CD3-ECD/CD8-PC7 : il permet de repérer,
parmi les lymphocytes, les cellules exprimant à la fois CD3 et CD8 (L2) et de placer
une Bitmap au niveau des lymphocytes CD3+ CD8+.
un histogramme monoparamétrique CFSE/Count : il permet d’analyser la
répartition de l’intensité de fluorescence du CFSE parmi les lymphocytes CD3+
CD8+
Figure 29 : Exemples d’histogrammes biparamétriques et monoparamétriques utilisés pour
l’étude de la prolifération de cellules T allogéniques dans une réaction mixte
lymphocytaire.
CFSE CD3-ECD C D 4 -PC 5 CD3+CD4+ STRUCTURE T A IL L E CD3-ECD S T R U C T U R E CFSE CD3-ECD CFSE C D 4 -PC 5 CD3+CD8+III -ANALYSES STATISTIQUES
Toutes les études statistiques de ce travail ont été réalisées à l’aide du logiciel
GraphPadPrism™ (San Diego, Californie, USA). La normalité de la distribution des résultats
a été testée par le test de Kolmogorov Smirnoff.
Les comparaisons de l’expression des différents TLRs entre les patients atteints de
LLC-B et les sujets sains ont été réalisées par un test T de Student (p<0.05). En l’absence de
distribution normale, ces résultats ont été analysés par un test de Mann-Whitney non apparié
(p<0.05).
Les analyses immunophénotypiques réalisées au niveau des suspensions cellulaires
saines et tumorales ont été comparées avant et après stimulation par un test T de Student
apparié (p<0.05).
La comparaison de la sécrétion de cytokines par les différentes suspensions cellulaires
stimulées ou non a été réalisée par un test T de Student apparié (p<0.05) ou, en l’absence de
distribution normale, par un test de Wilcoxon apparié (p<0.05). Les profils cytokiniques
obtenus dans les suspensions de LLC-B ont été comparés à ceux obtenus dans les suspensions
amygdaliennes par un test T de Student (p<0.05) ou, en l’absence de distribution gaussienne,
par un test de Mann-Whitney non apparié (p<0,05).
La prolifération des lymphocytes T naïfs en réponse aux cellules B saines et tumorales
stimulées a été comparée aux résultats obtenus avec des cellules B saines et tumorales non
stimulées par un test T de Student apparié (p<0.05).
I - ETUDE DE L’EXPRESSION DES TLRS
L’étude du profil d’expression des TLRs sur les lymphocytes B normaux a été réalisée
par cytométrie de flux au niveau de prélèvements sanguins de volontaires sains et de
suspensions cellulaires éluées d’amygdales palatines. Les résultats obtenus pour ces cellules B
témoins on été comparés avec ceux observés pour des cellules B de patients atteints de LLC.
Dans les échantillons de patients atteints de LLC-B les proportions de cellules
leucémiques étaient comprises entre 63 et 98% (moyenne : 81.3 + 3.4). Les proportions de
cellules T et B normales persistantes étaient respectivement comprises entre 1 et 20.8%
(moyenne : 2.7 + 0.8) et 0 et 8% (moyenne : 7 + 2.3). Tous les patients présentaient un score
de Matutes de 4 ou 5 et aucune expression de CD38 n’a été relevée.
Dans les suspensions cellulaires obtenues à partir du sang périphérique des sujets sains
et d’amygdales palatines, les proportions de cellules B CD19+ étaient respectivement
comprises entre 2.3 et 14.6% (moyenne : 9.6 + 1.7) et entre 62 et 87% (moyenne : 72.4 + 2.7).
D’autre part, les proportions de cellules CD19+/CD5+ étaient respectivement comprises entre
0.5 et 5.5% (moyenne : 2.2 + 0.5) et entre 1 et 20% (moyenne : 7.3 + 2.1).
L’expression des TLRs a été ainsi été analysée au niveau des cellules B CD19+ de 17
sujets contrôles âgés de 25 à 55 ans (moyenne d’âge de 38 + 0.6 ans), de 12 amygdales
palatines d’enfants âgés de 3 à 7 ans (moyenne d’âge de 4.9 + 0.5 ans) et de 18 patients âgés
de 43 à 82 ans (moyenne d’âge de 63 + 2.7 ans).
Dans le document
Expression et fonctionnalité des Toll-Like récepteurs par les cellules de leucémie lymphoïde chronique B
(Page 127-132)