Méthode et expérience

Dans le cas présent, l'étude vise à évaluer la robustesse de la technique DIAMS, pour cela, la marche à suivre consiste à répéter plusieurs fois une même analyse et à comparer les spectres de masse obtenus.

Pour permettre une analyse statistique des résultats, il faut identifier une grandeur mesurable qui traduise la morphologie du spectre, deux principaux candidats se présentent : l'intensité des pics d'intérêt ou leur aire. Le choix s'est porté sur l'intensité des pics en question car le calcul des aires par le logiciel d'acquisition est trop souvent incorrect, de plus, comme c'est l'allure du spectre qui importe, les intensités relevées sont normalisées afin de s'affranchir de l'irrégularité des valeurs brutes.

D'autre part, il est possible de comparer la méthode DIAMS à des méthodes de référence comme le MALDI, puisque c'est la technique phare de la désorption/ionisation laser, ou la LDI classique, qui, en même temps d'être la première technique LDI, est aussi la première technique sans matrice, en effectuant les mêmes séries de mesures avec les différentes méthodes.

La technique DIAMS est destinée à analyser des molécules de rapports m/z variables, son évaluation doit donc porter sur une gamme de masse afin de vérifier que la fidélité ne dépende pas du rapport m/z. L'échantillon de référence est un panel de 5 glycérides de masses inférieures au kilodalton : un monoglycéride (1-Monopalmitoleoyl-rac-glycerol), deux diglycérides (1,3-dipalmitoyl-glycerol, 1,3-distearate-glycerol) et deux triglycérides (glyceryl tritridecanoate, tripalmitin).

Pour évaluer la méthode DIAMS, nous fixons les conditions suivantes :

• Toutes les plaques utilisées sont préparées en suivant le protocole décrit précédemment et testées par électrochimie.

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• Les spectres de masse sont tous enregistrés dans les mêmes conditions en utilisant un programme d'acquisition automatique pour limiter les erreurs systématiques.

• Une normalisation des valeurs mesurées est établie.

• Une solution standard de glycérides est directement déposée sur la plaque DIAMS, sur une plaque d'or ou en MALDI.

Pour les besoins de l'étude de robustesse, le protocole d'obtention des spectres de masse a été rigoureusement défini.

5.1.1 Préparation des dépôts

La solution de référence est préparée de façon à contenir 2.10^-2 g.L^-1 de chaque glycérides dissous dans un mélange chloroforme/méthanol : 2/1, ainsi que des solutions de matrice DHB (acide dihydroxybenzoïque) à 20 g.L^-1 utilisée en MALDI et d'iodure de sodium (NaI) à 7 g.L^-1 qui sert d'agent cationisant

Pour les analyses en MALDI, la solution de standards et la solution de DHB sont mélangées en respectant un rapport volume/volume : 1/1, de même, quand cela sera nécessaire, l'iodure de sodium sera ajouté en mélangeant la solution standard à la solution de NaI suivant un rapport volume/volume : 10/1.

Tous les dépôts sont réalisés par la méthode de la goutte séchée, une goutte, de 0.5 µL pour le DIAMS et le LDI et de 1 µ L pour le MALDI, est déposée sur le substrat puis évaporée à l'aire libre.

5.1.2 Conditions de l'analyse

Les mesures sont réalisées sur le spectromètre de masse à temps de vol Biflex III qui dispose d'une option d'acquisition automatique de spectres. Son utilisation permet une sélection des spectres enregistrés en fonction de leur résolution et du rapport signal sur bruit dans une gamme de masse définie.

Hormis pour la puissance laser, l'ensemble des spectres est enregistré avec les mêmes paramètres :

• Tensions d'accélération (19 kV et 17.3 kV),

• Délai d'extraction (200 ns),

• Tension d'amplification appliquée au détecteur (1.3 kV),

• Refocalisassion des ions par le miroir électrostatique,

• Pas de déflection des ions de basse masse.

Et subissent le même traitement qui permet d'obtenir les grandeurs évaluées :

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• Normalisation des intensités en ne considérant que les pics d'intérêt.

Selon la technique d'ionisation, deux puissances laser ont été utilisées, ~3µJ/pulse (pour 70% d'atténuation laser) et ~9µJ (pour 30% d'atténuation laser).

5.1.3 Spectres de masse de Glycérides typiquement obtenus

Tout comme en MALDI-TOF,^72-76 les glycérides sont facilement détectés en spectrométrie de masse DIAMS. Le spectre type résultant de l'analyse DIAMS-MS du mélange standard utilisé dans cette étude est reporté dans la Figure 2.23. Les cinq glycérides apparaissent uniquement sous forme d'adduits sodium et potassium.

L'intensité de chacun des dix pics correspondant est relevée et normalisée en fonction de leur somme, c'est cette intensité normalisée qui sert de mesurande pour l'étude de robustesse de la méthode.

Figure 2.23 : Spectre de masse DIAMS-MS du mélange de glycérides :

1-Monopalmitoleoyl-rac-glycerol (G1, Mw = g.mol^-)¹, 1,3-dipalmitoyl-glycerol (G2, Mw = 568.93 g.mol^-1),

1,3-distearate-glycerol (G₃, Mw = 625.02 g.mol^-1), glyceryl tritridecanoate (G₄, Mw = 681.08 g.mol^-1) et

tripalmitin(G5, Mw = 807.32 g.mol^-1) [mode linéaire positif; laser 30%; 200 accumulations]

La comparaison des spectres obtenus en DIAMS, en MALDI et en LDI (Figure 2.24), montre que le DIAMS permet de minimiser la présence d'ions parasites dans la gamme des bas rapports m/z. En MALDI, les ions qui apparaissent en dessous de m/z 400 sont généralement associés à des ions provenant de la matrice utilisée.77

En LDI, ils correspondent plutôt à des ions formés suite à la pyrolyse des analytes lors de l'irradiation laser.

97 Figure 2.24 : Spectres de masse MALDI et LDI du mélange de glycérides :

1-Monopalmitoleoyl-rac-glycerol (G₁, Mw = g.mol^-)¹, 1,3-dipalmitoyl-glycerol (G₂, Mw = 568.93 g.mol^-1),

1,3-distearate-glycerol (G₃, Mw = 625.02 g.mol^-1), glyceryl tritridecanoate (G₄, Mw = 681.08 g.mol^-1)

et tripalmitin(G₅, Mw = 807.32 g.mol^-1)

5.1.4 Effet de la puissance laser :

Pour étudier l'influence de la puissance laser en DIAMS, les spectres de masse du mélange de glycérides ont été enregistrés en mode positif avec différentes valeurs d'atténuation.

Au dessus de 70% d'atténuation, très peu d'ions sont produits et le spectre de masse est quasiment vierge.

L'atténuation seuil est atteinte autour de 70%. La quantité d'énergie laser déposée est alors assez importante pour générer des ions par désorption/ionisation des molécules d'échantillon. Pour les glycérides, ce sont principalement des adduits sodium (MNa⁺) et potassium (MK⁺) qui sont observés.

Lorsque l'énergie laser utilisée augmente, des pics caractéristiques de la dégradation de la plaque sont détectés, en effet pour des atténuations inférieures à 30%, des clusters d'or apparaissent sur le spectre aux m/z 197, m/z 394 et m/z 591.

C'est pourquoi l'étude statistique sur le DIAMS est menée avec une atténuation de 70%, ce qui permet d'observer les analytes sans dégrader le substrat.

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5.2 La répétabilité