6 QUANTIFICATION EN DIAMS-MS : DOSAGE D’UN COMPOSE DE FAIBLE POIDS
6.2 Dosage dans un plasma bovin
7 5 3 7 4 3 7 6 3 0.255 0.01 C H O C HD O I C H O I − − = − (2.10)
avec un coefficient de corrélation de 0.988, ce qui démontre une très bonne linéarité entre les intensités relatives des pics et les concentrations des solutions d'acide salicylique étudiées sur la gamme de concentration observée.
D'autre part, sachant que la référence deutérée est introduite avec une concentration de 4mM, l'équation attendue pour la droite de calibration était :
[ ]
[ ] [ ] [ ]
7 5 3 7 4 3 7 6 3 7 6 3 7 6 3 7 6 3 0.25 4 C H O C HD O I C H O C H O C H O I C D O − − = = = (2.11)La droite expérimentale recoupe donc bien la courbe d'étalonnage attendue, ce qui garantie l'efficacité de la technique de dosage.
6.2 Dosage dans un plasma bovin.
Dans une matrice simple comme l'eau, le dosage de l'acide salicylique s'est montré très efficace, cependant l'application à un cas pratique est souvent plus délicate. Pour vérifier que cette méthode soit adaptée à une matrice réelle et plus complexe, un dosage de l'acide salicylique contenu dans un plasma bovin a été effectué.
111 Le dosage est généralement effectué en prélevant un échantillon sanguin chez un patient ayant, au préalable, reçu de l'aspirine. Chez l'humain et dans le cadre d'un usage thérapeutique, la concentration d'acide salicylique retrouvée dans le sérum est typiquement de l'ordre de 0.7 à 1.4 mM (100–200 mg/L). Pour des concentrations supérieures, l'effet reste modéré jusqu'à environ 7 mM où le taux est considéré comme toxique. Dans le cas présent, l'étude a été réalisée avec des échantillons de plasma dopés avec de l'acide salicylique en concentration variable, de 0.5 à 2.5 mM et avec 1.8 mM d'acide salicylique deutéré.
6.2.1 Expérience : Préparation de l'échantillon et obtention des spectres de masse
Les échantillons de plasma bovin ont été obtenus auprès d'un laboratoire Intervet de recherche pharmaceutique vétérinaire, puis ont été conservés à -20°C jusqu'à utilisation. Après décongélation, les échantillons sont dopés en mélangeant 5 mL d'une solution d'acide salicylique et de référence deutérée dans l'eau avec 5 mL de plasma. Quatre solutions sont préparées contenant 0.7, 1.4, 2.8 et 3.5 mM d'acide salicylique et 1.8 mM de référence.
Le traitement des échantillons comporte deux étapes :
• Une centrifugation de 3 minutes à 10000 tours par minute (rpm), une pellicule solide se forme alors à la surface et la phase liquide est récupérée.
• Une extraction sur phase solide (SPE) phase inverse qui permet de supprimer une grande partie des composés indésirables de la matrice et de récupérer les composés d'intérêt.
L'extraction, réalisée sur un banc à vide en utilisant une cartouche StrataX 33 µm de Phenomenex, comporte plusieurs étapes, au cours desquelles différentes solutions sont percolées à travers la cartouche :
• Conditionnement de la cartouche SPE :
6 mL de méthanol
6 mL d'eau
• Chargement de la cartouche :
10 mL de la solution d'échantillon
• Lavage de la cartouche :
10 mL d'eau contenant 5% de méthanol
• Elution de l'analyte :
10mL d'un mélange Eau/Méthanol : 40/60.
Lors de l'étape de chargement, les composés d'intérêt sont piégés par affinité avec le substrat. Le rinçage permet de chasser les composés non retenus, tels que les sels, les lipides ou les protéines,
112 enfin, les composés d'intérêt sont récupérés par élution d'un solvant moins polaire qui va les entrainer sur son passage. Le solvant d'élution, qui contient les composés d'intérêt, est analysé par spectrométrie de masse DIAMS. Pour chacun des quatre extraits, trois gouttelettes de 0.7 µ L sont successivement déposées sur le même emplacement d'une plaque DIAMS et évaporées à l'air libre. Ces dépôts sont ensuite analysés par DIAMS-MS pour établir une courbe d'étalonnage d'un dosage de l'acide salicylique. Ce sont en réalité quatre séries de quinze spectres qui sont enregistrées afin de déterminer un intervalle d'erreur pour chaque mesure.
6.2.2 Résultats :
L'analyse des extraits par DIAMS-MS révèle clairement la présence de l'acide salicylique et de son équivalent deutéré, en effet le spectre de masse obtenu à partir d'un extrait, Figure 2.32, présente les deux pics correspondant à m/z 137 et m/z 141.
Figure 2.32 : Spectre de masse DIAMS-MS de l'extrait SPE du plasma contenant de l'acide salicylique et son équivalent deutéré. [mode linéaire négatif; laser 50%; 300 accumulations] Les séries de mesures effectuées pour les 4 concentrations d'acide salicylique rendent compte de l'évolution des abondances relatives de l'acide salicylique par rapport à l'équivalent deutéré en fonction de la quantité d'acide salicylique introduite dans le plasma (Figure 2.33).
m/z
0 100 200 300
113 Figure 2.33 : Courbe d'étalonnage du dosage de l'acide salicylique dans le plasma bovin. Trois des quatre points expérimentaux son alignés et permettent de tracer une droite d'étalonnage d'équation :
[ ]
7 5 3 7 4 3 7 6 3 0.566 0.144 C H O C HD O I C H O I − − = − (2.12)avec un coefficient de corrélation de 0.988, malgré la complexité du milieu, la linéarité entre les intensités relatives et la concentration d'acide introduite est retrouvée. D'autre part, sachant que la référence deutérée est introduite avec une concentration de 1.8mM, la relation attendue entre les deux variables est :
[ ]
[ ] [ ] [ ]
7 5 3 7 4 3 7 6 3 7 6 3 7 6 3 7 6 3 0.556 1.8 C H O C HD O I C H O C H O C H O I C D O mM − − = = = (2.13)La pente expérimentale correspond donc bien à la pente attendue, par contre le décalage au zéro pour une concentration nulle peut mettre en balance la justesse de ce dosage si la droite d'étalonnage n'est pas établie au préalable.
La finesse des intervalles d'erreur sur chaque moyenne, indique que les mesures sont très précises, dans cette gamme de concentration, ce qui est aussi observé lors du dosage dans l'eau où la dispersion des mesures ne se fait sentir qu'au dessus d'une concentration d'acide de 10mM. Il reste toute de même à noter que le point correspondant à la concentration d'acide salicylique de 2.8 mM n'a pas été pris en compte pour l'obtention de cette droite de régression, car il est excentré ce qui
114 doit correspondre à une erreur lors de l'étape de préparation du plasma ou de l'extraction, cette mesure aurait mérité d'être refaite, ce qui n'a pas été le cas par manque de plasma. En somme, dans le cas d'une matrice simple, le dosage est particulièrement efficace, dans ce cas l'utilisation de la technique d'ionisation DIAMS permet une quantification qui n'aurait pas été possible en MALDI classique à cause de la présence des ions de matrice dans la gamme de masse de l'acide salicylique. En revanche, son utilisation associée à un prétraitement de l'échantillon induit une erreur systématique de l'ordre de 0.25nM sur la concentration mesurée, elle peut être imputée à l'étape de prétraitement ou à la composition de l'échantillon de plasma.