La mutagénèse de 1,6 g (∼ 80000 graines) de graines d’Arabidopsis Coler105,
de génération dite "M0" a été réalisée par Thierry Desnos (Laboratoire de Biologie du Développement des Plantes, iBEB, CEA Cadarache) par un traitement en présence de
69 méthanesulfonate d'éthyle (EMS) 0,2% pendant 16 heures. L’EMS est un agent alkylant qui induit des modifications chimiques des nucléotides, provoquant un mésappariement des bases de l’ADN et de ce fait des mutations ponctuelles. Dans la majorité des cas, l’EMS induit un changement de la base cytosine (C) en thymine (T). L’inactivation de l’EMS est faite avec du thiosulfate de sodium 1 M, puis 10 rinçages à l’eau. Un semis de la génération devenue M1 après la mutagénèse, est ensuite réalisé sur des barquettes de terreaux. Cent cinquante-six pools de graines de génération M2 sont récoltés à partir de 500 plantes de génération M1. C’est à partir de la génération M2 que le criblage décrit dans ce mémoire a été réalisé.
4. Croisements entre lignées d'Arabidopsis
Un croisement s’effectue entre 2 plantes afin d’obtenir une population hybrides, issue des génomes parentaux. Suite à la sélection de plantes d'écotype Coler105 porteuses de mutation(s) conférant une résistance à la galvestine-1 (criblage suivant la méthode décrite en II), les croisements ont été réalisés entre plantes résistantes et plantes non mutées (sauvages
ou WT) d'écotype Coler105. Le croisement est effectué entre un gamétophyte femelle (ou sac
embryonnaire contenant l'oocyte) sauvage et un gamétophyte mâle (ou pollen), d'un mutant. Les plantes sont cultivées en parallèle afin de produire des fleurs matures de façon synchrone. Des boutons floraux de plantes sauvages prêts à s’ouvrir sont sélectionnés. Les étamines sont retirées soigneusement à l'aide de pinces fines, en écartant les pétales et les sépales (Figure M 1). Le pollen d’une fleur provenant d’un mutant est déposé à la surface du pistil d'une plante
Coler105 ainsi préparée. La silique se forme 3 jours plus tard et est récoltée 4 semaines après le
croisement. Lorsqu’un croisement est effectué entre une plante contrôle Coler105 et un mutant
gali, on parle de rétrocroisement ou « backcross ».
étamine pistil pétale
lignée gali
Col
er105 sépaleFigure M 1 : Schéma d’un rétrocroisement (ou « backcross ») entre une lignée gali et une plante contrôle (WT).
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La cartographie de mutations générées par EMS repose dans une première étape sur l’obtention d’une population de recombinants entre deux écotypes différents (le principe de la cartographie est décrit en IV.1.d). Pour cela un croisement est réalisé entre une plante
porteuse de mutation d’écotype Coler105 (gamétophyte mâle) et une plante WT d’écotype Ler
(gamétophyte femelle). La silique se forme 3 jours plus tard et est récoltée 4 semaines après le croisement, fournissant ainsi les graines de génération F1 hybrides, issues des génomes parentaux.
II. Crible pour la sélection de mutants d'Arabidopsis
thaliana résistants à la galvestine-1
Le principe et la mise au point du crible pour la sélection de mutants d'Arabidopsis résistants à la galvestine-1, inhibiteur de l'ensemble des MGDG synthases, sont décrits dans la partie résultats. Les lots de graines d’Arabidopsis thaliana, Coler105 (voir I.1.a.) issues d'une mutagenèse en présence de méthanesulfonate d’éthyle (EMS) ont été fournis pour ce travail par Thierry Desnos, Laboratoire de Biologie du Développement des Plantes, iBEB, CEA Cadarache. Ces lots de graines de génération M2 ont été obtenus à partir d’environ 500 plantes de génération M1 et ont été répartis en 156 lots. Le criblage a été réalisé en soumettant 50 de ces lots de graines, soit au total environ 100,000 graines correspondant à environ 150,000 mutations aléatoires dans le génome, à une pression en galvestine-1 de 100 µM, sur milieu gélosé préparé selon le protocole décrit plus haut (voir I.1.c.). Cinq-cent-quarante-cinq graines ont été semées par boites de pétri de 145 mm de diamètre. Les boites ont ensuite été placées à 4°C et à l'obscurité pour stratification pendant 2 jours, avant d’être transférées en chambre de culture en cycle long (humidité 60%, 22°C ; lumière blanche de densité de flux de photons de 70 µE.m-2.s1). Pendant 3 jours, les boites ont été conservées à l’obscurité, permettant aux plantules de croître sans utiliser la photosynthèse, réduisant ainsi les effets de la galvestine-1 au niveau des chloroplastes, et en présence d'une teneur élevée en saccharose permettant une germination en conditions hétérotrophes. Après 3 jours, les plantules ont été soumises à une photopériode de 16h jours / 8h d’obscurité (lumière blanche de densité de flux
de photons de 70 µE.m-2.s-1). Après 15 jours de culture, les plantes résistantes à la galvestine-
1 sont restées vertes alors que les plantes sensibles sont devenues chlorotiques. Un crible secondaire a été mis en œuvre pour confirmer la résistance, en transférant les plantes sur un milieu gélosé avec une plus haute teneur en galvestine-1 (250 µM), durant 7 jours, et dans les
71 mêmes conditions de culture. Les plantes qui ne deviennent pas chlorotiques après ce second crible ont été sélectionnées, considérées comme étant résistantes à la galvestine-1, et soumises à des études de génétiques et d'analyses phénotypiques décrites dans la partie Résultats. Les lignées ont été nommées « gali » (galvestine-1 insensitive).
III. Visualisation par Microscopie
Le phénotype des plantes est observé à différents niveaux, tout d'abord macroscopique en mesurant les écarts éventuels de croissance ou de développement des parties végétatives ou fertiles, ou les aberrations éventuelles de leur développement. De façons systématique, le phénotype est aussi analysé au niveau microscopique, de façon sommaire à l'aide d'une loupe binoculaire (Olympus SZX12), au grossissement X10 et X25. Des captures d'images sont réalisées à l'aide d'une caméra digitale Nikon DXm1200C et les traitements d’images sont réalisés à l'aide du logiciel ImageJ.
Des analyses plus fines sont réalisées à l'aide d'un microscope confocal (LEICA TCS- SP2), doté d'un système d'épifluorescence. Pour les parties végétatives chlorophylliennes, un fragment de feuille est coupée et montée entre lame et lamelle avec de l’eau. L’observation des chloroplastes se fait par autofluorescence de la chlorophylle, qui est excitée à 633 nm par un laser He-Ne. La fluorescence de la chlorophylle est collectée entre 658 et 700 nm. Des analyses ont été réalisées au grossissement X40, avec système d'immersion dans de l’huile. Des captures d'images sont réalisées à l'aide d'une caméra intégrée au microscope et les traitements d’images sont réalisés à l'aide du logiciel Leica confocal Software.
Une étude plus poussée du phénotype est envisagée pour les plantes les plus intéressantes, avec en particulier une caractérisation du profil glycérolipidomique membranaire (voir plus loin).
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