Afin de mieux comprendre le rôle de Foxo3 dans les lymphocytes T CD4 et d’avoir une idée des gènes régulés par Foxo3 dans les LT CD4, nous avons analysé par « microarray », l’expression globale des transcrits dans les LT CD4 compétents ou déficients pour Foxo3, naïfs ou stimulés avec de l’anti-CD3 durant 12 ou 24 heures. A l’état basal, seulement 4 gènes sont différentiellement exprimés entre les LT CD4 Foxo3+/+ et Foxo3-/-, ce qui suggère soit que Foxo3 pas ou peu impliqué dans les LT CD4 naïfs, soit que Foxo1 jouerait un rôle redondant et permettrait de maintenir la quasi-totalité des gènes contrôlés par Foxo3. En revanche, à 12 heures post- stimulation, de nombreux gènes se retrouvent différentiellement exprimés et 2 voies majeures apparaissent fortement impactées : la voie « trafic cellulaire » qui est
fortement surexprimée et la voie « IFN-g/réponse à l’IFN-g» qui est au contraire sous- exprimée dans les LT Foxo3 KO.
Parmi les gènes surexprimés appartenant au trafic cellulaire, de nombreux gènes sont des gènes cibles connus de Foxo1 comme notamment Fam65b, Sell et
S1pr1 qui codent respectivement pour Fam65b, CD62L et S1P1 (Kerdiles, Beisner et
al. 2009, Rougerie, Largeteau et al. 2013).
Ces résultats laissent penser qu’en absence de Foxo3, Foxo1 serait plus actif afin de compenser l’absence de Foxo3. Une autre explication serait que Foxo3 pourrait moduler l’activité de Foxo1. Cette modulation pourrait passer par la compétition pour des cofacteurs communs aux deux protéines.
Cependant, cet impact de la déficience en Foxo3 sur la migration des LT ne semble pas être impliqué dans la résistance des souris Foxo3 KO à l’EAE. En effet, nous avons pu mettre en évidence que les souris Foxo3-/- présentent une susceptibilité diminuée à la maladie. Or, cette pathologie est fortement dépendante de la migration des LT pathogéniques au niveau du système nerveux central (Stromnes, Cerretti et al. 2008). Pourtant, nos résultats montrent que les LT CD4 Foxo3KO sont bel et bien capables de migrer au niveau du cerveau et de la moelle épinière, ce qui exclue donc un défaut de migration de ces cellules. En revanche, la capacité pro-inflammatoire des LT CD4, que ce soit en périphérie ou au niveau du SNC, est fortement diminuée, surtout en ce qui concerne les LT CD4 producteurs d’IFN-g et de GM-CSF.
Ainsi, au vu de nos résultats in vitro et in vivo, l’impact de la déficience en Foxo3 sur la voie de l’IFN-g et de sa réponse, semble relever d’un intérêt particulier pour expliquer notre phénotype. En effet, l’analyse par microarray a révélé que le gène le plus différentiellement sous-exprimé entre les LT CD4 WT et Foxo3-/- est le gène qui
code pour Eomesodermin (ou Eomes). Nous avons confirmé ces résultats par qPCR et au niveau protéique par cytométrie en flux. Afin de déterminer si Eomes est bien un gène cible de Foxo3, nous avons cherchés in silico des site putatifs des facteurs Foxo (5’-TTGTTT(A/T)C-3’ ou 5’ C(A/T)AAAGAA-3’ à l’aide des sites rVista et USCD genome browser (https://rvista.dcode.org et https://genome.ucsc.edu ). Nous avons trouvé 3 sites potentiels, un premier situé dans la région promotrice et un second après le gène Eomes, au sein d’une région hautement conservée au cours de l’évolution. Cette région hautement conservée est riche en sites de fixation de facteurs de transcription et est sensible à la DNAse I, ce qui suggère que cette zone pourrait être
une zone de régulation de type « enhancer » que nous avons nommés « 3’UTR-E ». Par la suite nous avons pu mettre en évidence grâce à des expériences d’immuno- précipitation de la chromatine que Foxo3 est capable de se fixer au niveau de ces 3 régions avec une fixation préférentielle au niveau des sites de fixation de la région enhancer « 3’-UTR-E ». Ces résultats sont très intéressants pour plusieurs raisons : premièrement, dans les LT CD8, plusieurs études ont montré que Foxo1 permettait d’induire l’expression d’Eomes, qui est lui-même nécessaire à la transition vers un phénotype T CD8 mémoire (Rao, Li et al. 2012, Hess Michelini, Doedens et al. 2013, Tejera, Kim et al. 2013). Dans notre cas, bien que Foxo1 soit exprimé par les LT CD4, son expression n’est pas suffisante pour induire l’expression d’Eomes et ainsi compenser l’absence de Foxo3. Ces résultats suggèrent donc un rôle non-redondant de Foxo1 et Foxo3 dans les LT CD4 et les LT CD8. En effet, nous avons montré que la déficience en Foxo3 dans le compartiment T CD8 n’impacte pas l’expression d’Eomes, suggérant que Foxo1 suffit au contrôle d’Eomes dans les LT CD8. Deuxièmement, il a été mis en évidence que Foxo3 se fixe préférentiellement au niveau de zones de type « enhancer » et que sa fixation permet d’amplifier les marques actives de la transcription telles que l’acétylation de l’histone H3 sur sa lysine 27 (H3K27Ac) ou le recrutement de l’ARN polymérase II. Néanmoins, il semblerait que la fixation de Foxo3 puisse réguler un grand nombre de gènes et que sa fixation au niveau des régions « enhancer » soit hautement dépendante de l’activité de celui-ci. En parallèle, Foxo3 peut lui-même se fixer sur des régions « enhancer » non actives, y recruter des modificateurs d’histones et les rendre permissives (Eijkelenboom, Mokry et al. 2013, Eijkelenboom, Mokry et al. 2013). Ainsi, Foxo3 agirait comme un activateur de la transcription des gènes via le recrutement de l’ARN polymérase II et par le remodelage de la structure de la chromatine afin de rapprocher les régions « enhancer » des régions promotrices (Eijkelenboom, Mokry et al. 2013). Le modèle proposé du mode d’action de Foxo3 est représenté ci-dessous (Figure 26).
Figure 26 – Modèle proposé pour la régulation des gènes cibles de Foxo3 (Extrait de Eijkelenboom et al., 2013)
Des études ont montré que Foxo3 régulait la majeure partie de ses gènes cibles de manière directe (Eijkelenboom, Mokry et al. 2013). Pour ce qui est de la régulation d’Eomes, nos résultats de ChIP montrent que Foxo3 est capable de se fixer au niveau de régions qui correspondent au locus d’Eomes, mais cette technique n’apporte pas la preuve irréfutable d’une liaison directe de Foxo3 à l’ADN (Gordan, Hartemink et al. 2009). En effet, il est possible que Foxo3 fasse partie d’un complexe transcriptionnel où il jouerait le rôle de cofacteur et exercerait ses fonctions via des interactions protéines-protéines. Afin d’apporter la preuve formelle que Foxo3 régule directement l’expression d’Eomes, une forme mutée sur le domaine de fixation à l’ADN de Foxo3 a été générée et des expériences de « gène-rapporteur » ont été réalisées. Nos résultats montrent que l’interaction du DBD (DNA-Binding Domain) est indispensable à l’activation du promoteur Eomes, démontrant ainsi qu’Eomes est bien un gène cible direct de Foxo3 dans les LT CD4.